不同抗原在小鼠脾脏和胸腺内诱导的免疫效应

摘要

研究背景及目的:
　　胸腺是哺乳动物的中枢免疫器官，骨髓来源的前T淋巴细胞在此发育、分化和成熟，然后迁移到外周免疫器官参与免疫应答，胸腺为T淋巴细胞的发育过程提供了必要的微环境，经典的免疫学理论认为，T细胞在发育的过程中会与表达自身MHC分子的细胞相互作用，经历阳性选择和阴性选择筛选出对外界抗原免疫应答而对自身抗原免疫耐受的成熟T淋巴细胞。同时根据中枢耐受的诱导理论，T淋巴细胞在发育成熟的过程中，一旦接触到同种异基因抗原就会诱导出对该抗原免疫耐受。由于血胸屏障的存在，血液中的大分子物质包括外界抗原不能够进入胸腺，所以早前对于胸腺内的免疫及其相关机制研究未能受到关注。
　　脾脏是哺乳动物的外周免疫器官，当外界抗原侵入机体，在脾脏会引发特异性的细胞免疫和体液免疫。脾脏内也存在血-脾屏障，血-脾屏障有很强的选择透过性，这种选择性针对的是抗原的性质而非完全是抗原的大小，但抗原在脾脏内发生免疫应答时是否对胸腺的微环境有影响？目前却鲜有报道。
　　为探索不同抗原在小鼠脾脏和胸腺内诱导的免疫效应，我们首先采用AFP（人甲胎蛋白）作为外源性抗原分子，对C57BL/6小鼠进行免疫，研究胸腺和脾脏对外界抗原的免疫状态有何不同，并采用人肝癌细胞HepG2作为异种抗原细胞在C57BL/6小鼠胸腺内注射的方法，研究了异种抗原细胞在胸腺中的命运及其可能诱导的免疫效应。
　　研究方法:
　　1.外源性抗原分子（人AFP）经外周免疫后对小鼠脾脏和胸腺的影响
　　1) C57BL/6小鼠的外周AFP免疫
　　2) C57BL/6小鼠脾脏和胸腺称重及各自总淋巴细胞的计数
　　3) C57BL/6小鼠脾脏石蜡切片的制作及HE染色
　　2.外源性抗原细胞（人HepG2）在小鼠胸腺内诱导的免疫应答
　　1) C57BL/6小鼠胸腺发育情况的分析
　　2) HepG2细胞培养与荧光材料DiI标记
　　3) HepG2细胞的C57BL/6小鼠胸腺内注射及注射结果的解剖学观察
　　4)不同时间检点的胸腺石蜡切片的制作与HE染色观察
　　5)不同时间检点的石蜡切片与荧光显微镜观察
　　研究结果:
　　第一部分
　　1.一次免疫组小鼠的脾脏重量和总淋巴细胞数比对照组小鼠的脾重和总淋巴细胞数略微提高，胸腺重量和总淋巴细胞数较对照组都略微降低，但总体变化不明显。再次免疫组的脾脏重量与总淋巴细胞数与对照组和一次免疫组有明显的差别，其重量是对照组的2.6倍以上，总淋巴细胞数目是对照组的10倍以上，再次免疫组的胸腺重量与一次免疫组和对照组无明显差异。
　　2.一次免疫组小鼠的脾脏白髓与红髓比例与对照组相似，而再次免疫小鼠的脾脏白髓比例明显增加。
　　第二部分
　　1.C57BL/6小鼠胸腺从出生到青春发育期一直在快速的增长，其体积和重量都有明显增加，在6周左右时到顶峰，之后胸腺开始萎缩，体积变小，重量下降。
　　2.HepG2细胞被全部标记，在绿色荧光的激发下细胞发出强烈的红色荧光。
　　3.不同时间检点的胸腺都显现出被标记的肿瘤细胞或组织，表明肝癌细胞在胸腺内注射成功。
　　4.小鼠胸腺对异种抗原细胞产生免疫排斥，3-14天胸腺上皮细胞对肿瘤组织进行完全包绕，逐步出现淋巴细胞浸润，巨噬细胞聚集，最终导致肿瘤组织坏死。
　　5.在肿瘤组织形成初期，周围聚集有大量的淋巴细胞，5天左右出现淋巴细胞在肿瘤组织内的浸润，7天左右肿瘤细胞出现大量死亡，在肿瘤块中心的淋巴细胞浸润区可观察到有空洞状斑块的出现。
　　结论:
　　1.AFP抗原免疫小鼠18周后诱发的免疫应答基本处于静态复原状态，再次接触同种抗原，小鼠脾脏内会发生强烈的免疫应答，而胸腺内几乎未见有应答的征象。
　　2.小鼠胸腺内注射的HepG2肿瘤细胞初期会形成肿瘤组织，在第5天到14天，肿瘤组织区有淋巴细胞和巨噬细胞的浸润，最终肿瘤细胞被清除。表明异种抗原细胞在小鼠胸腺内引起的免疫排斥反应，是由胸腺微环境的组织特征决定的。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论(包括文献综述)

1．1 研究背景

1．1．1 胸腺的结构与功能

1．1．2 T细胞在胸腺内的成熟过程及其所经历的分子事件

1．1．3 胸腺对机体的免疫调节作用

1．1．4 胸腺对外周免疫的影响与MHC中枢控制

1．1．5 脾脏的组织结构及功能

1．1．6 AFP(甲胎蛋白)

1．1．7 HepG2(人肝癌细胞)

1．2 课题的提出及意义

第二章 外源性抗原分子经外周免疫后对小鼠脾脏和胸腺的影响

2．1 仪器设备

2．2 试剂材料

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂及其配制

2．3 实验方法

2．3．1 小鼠的免疫

2．3．2 小鼠脾脏称重及细胞提取计数

2．3．3 小鼠胸腺称重及细胞提取计数

2．3．4 小鼠脾脏做组织切片及HE染色

2．4 实验结果

2．4．1 小鼠脾脏重量及细胞数

2．4．2 小鼠胸腺重量及细胞数

2．4．3 小鼠脾脏组织病理分析

2．5 讨论

第三章 外源性抗原细胞(人HepG2)在小鼠胸腺内诱导的免疫应答

3．1 仪器设备

3．2 试剂材料

3．2．1 实验材料

3．2．2 主要试剂及其配制

3．3 实验方法

3．3．1 不同发育阶段C57BL／6小鼠胸腺称重

3．3．2 细胞培养与DiI标记

3．3．3 HepG2细胞的胸腺内注射

3．3．4 注射结果的解剖学观察

3．4 实验结果

3．4．1 C57BL／6小鼠胸腺发育情况的分析

3．4．2 HepG2细胞DiI染色结果的观察

3．4．3 HepG2细胞的胸腺内注射结果观察

3．4．4 组织学分析的结果

3．5 讨论

论文总结与展望

前期共同研究论文及简述(2014年全国免疫学学术大会论文)

参考文献

攻读硕士学位期间发表的会议论文(SCI待发表)

致谢