转Bt基因(ry2A*和cry1C*)抗虫粳稻的培育

摘要

水稻作为世界上超过一半人口的主食，在粮食作物中占有举足轻重的地位。鳞翅目害虫是水稻生产上的主要虫害，每年给水稻的产量造成巨大损失。目前在水稻种质资源中尚未发现有效的抗虫品种，生产上主要依靠喷洒农药来防治虫害的发生。而近年来不断发展的植物转基因技术为培育高效抗虫水稻新品系开辟了新途径。
　　本研究以黄淮稻区主栽优良品种“圣稻13”和“镇稻88”为受体，利用已构建好的转化载体pBar13-cry2A*和pBar13-cry1C*通过农杆菌介导法分别转化镇稻88和圣稻13愈伤，共获得T0代转cry2A*基因植株92棵，T0代转cry1C*基因植株102棵。经Southern杂交确定单拷贝和Bt基因在后代中的遗传分析发现，92棵T0代转cry2A*基因植株中，30株为单拷贝整合，102棵T0代转cry1C*基因植株中，31株为单拷贝整合，其中转cry2A*基因的30个株系和转cry1C*基因的31个株系中分别有28个株系和29个株系符合3∶1的孟德尔遗传分离比例。对于符合孟德尔遗传规律的株系经过多代种植，通过田间抗虫性鉴定和农艺性状筛查，最终筛选到农艺性状良好并且能够稳定遗传的转cry2A*基因纯合株5个，转cry1C*基因纯合株系6个，并利用酶联免疫法对获得的纯合株系进行Bt蛋白含量检测，结果表明不同转基因株系之间蛋白含量是不同的，差别比较明显。本实验获得的抗虫转基因株系对螟虫的抗性较好且农艺性状良好，说明两个外源基因插入没有对水稻生长发育产生明显影响。外源基因可以稳定遗传，没有发现外源基因沉默现象。利用Tail-PCR的方法，确定cry2A*基因和cry1C*基因在受体水稻基因组中的插入位点，结果显示外源基因的插入位点不在水稻的功能基因组内。
　　本研究还利用黄淮稻区主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88为受体亲本，选择以籼稻明恢63为背景的转基因抗虫材料TT51(带有抗虫基因cry1Ab/1Ac)、T2A-1（带有抗虫基因cry2A*）、T1C-19（带有抗虫基因cry1C*）和以粳稻中花11为背景的转基因抗虫材料R J-5（cry1C*）为供体，分别进行杂交和回交转育。对每一世代后代单株，通过Basta抗性筛选，PCR鉴定，田间抗虫性鉴定以及农艺性状选择，最终培育出来源于TT51带有cry1Ab/1Ac基因的抗虫稳定株系3个，来源于T2A-1带有cry2A*基因的抗虫稳定株系2个，来源于T1C-19带有cry1C*基因的抗虫稳定株系3个，来源于RJ-5带有cry1C*的抗虫稳定株系2个。
　　本研究获得的抗虫转基因水稻对鳞翅目害虫表现很好的抗性，因此为抗鳞翅目害虫水稻的培育提供了很好的抗源。本实验所使用的供体亲本抗虫材料TT51已获得农业部颁发的安全证书，T2A-1和T1C-19也已向农业部提交安全证书的申请。利用已申请到安全证书的抗虫转基因材料作为亲本进行回交转育，获所得的抗虫转基因株系不需要再进行环境释放和中间试验，可直接进入生产性试验环节，节省了抗虫水稻新品种培育的时间，减小了工作量。本实验结合分子标记辅助选择、转基因育种技术与传统育种方法，将抗虫基因转入栽培品种中，为充分利用已获得的抗性转基因材料提供了广阔的前景。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 Bt基因研究进展

1．1．1 Bt菌

1．1．2 Cry蛋白的特性及类型

1．2 Cry蛋白的杀虫机理

1．3 转基因水稻获得的方法

1．3．1 农杆菌介导法

1．3．2 回交转育

1．4 转Bt基因水稻的研究进展

1．5 昆虫对转Bt基因作物产生抗性的对策

1．5．1 高剂量庇护所策略

1．5．2 基因堆叠策略

1．6 全球转基因作物产业化现状

1．7 转基因作物的安全性评价

第二章 两种Bt基因(cry2A*和!cry1C*)抗虫水稻的培育

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 水稻转化受体

2．2．2 转化载体和目的基因

2．2．3 农杆菌菌株

2．2．4 试剂

2．2．5 农杆菌介导的水稻遗传转化

2．2．6 T0代转基因植株PCR目的基因跟踪检测和Basta涂抹检测

2．2．7 T0代转基因植株Bt蛋白快速测定

2．2．8 T0代转基因植株的总DNA提取和Southern blotting检测

2．2．9 转Bt基因植株后代的遗传分析

2．2．10 转基因纯合株系的筛选及田间抗虫性鉴定

2．2．11 纯合株系Bt蛋白含量的测定

2．2．12 重要农艺性状及产量表现的田间调查

2．2．13 利用Tail-PCR的方法确定cry2A*基因和cry1C*基因的插入位点

2．3 实验结果

2．3．1 愈伤组织的诱导及农杆菌介导的水稻遗传转化

2．3．2 T0代转基因植株的PCR目的基因跟踪检测和Basta涂抹检测

2．3．3 T0代转基因植株Bt蛋白的快速测定

2．3．4 T0代转基因植株的Southern杂交

2．3．5 单拷贝转Bt水稻材料的遗传分析

2．3．6 纯合转基因水稻株系的筛选及田间抗虫性鉴定

2．3．7 纯合株系Bt蛋白含量的测定

2．3．8 转基因水稻的主要农艺性状分析

2．3．9 外源抗虫基因插入位点的确定

2．4 讨论

第三章 利用回交转育培育黄淮稻区抗虫转基因水稻新品系

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 亲本材料

3．2．2 杂交及回交转育

3．2．3 Basta抗性选择和PCR分子检测

3．2．4 转基因植株的田间抗虫性鉴定

3．2．5 转基因植株的田间农艺性状调查

3．3 实验结果

3．3．1 转育经过

3．3．2 Bt转基因植株除草剂抗性鉴定

3．3．3 Bt转基因植株PCR检测

3．3．4 转基因稳定品系的筛选及田间抗虫性鉴定

3．3．5 转基因水稻品系的产量及其它农艺性状分析

3．4 讨论

第四章 总结与展望

4．1 本研究的目的和意义

4．2 后续工作

参考文献

附录

致谢