肠-肝胆汁酸感受在十二指肠空肠旁路术缓解2型糖尿病中的作用及机制研究

摘要

本文主要从以下几方面进行了论述：
　　第一部分 T2DM大鼠及十二指肠空肠旁路术动物模型的建立及评价
　　目的：
　　本研究通过对T2DM大鼠实施十二指肠空肠旁路术(Duodenal-jejunalbypass，DJB)，进而研究其不依赖于减重作用的抗糖尿病机制。本实验主要探讨以下问题:(1)评估T2DM大鼠模型，保证该模型与人类T2DM的相似性;(2)检测DJB对T2DM大鼠模型糖代谢的影响，证明其对糖代谢具有改善作用;(3)观察DJB对本T2DM大鼠模型血脂指标的影响;验证其对血脂代谢具有改善作用;(4)观察DJB对肠道激素的影响，进一步分析其改善糖代谢的作用机制。(5)监测DJB术后血清胆汁酸浓度的变化，分析其与糖代谢指标的相关性。
　　方法：
　　首先选取Sprague Dawley大鼠用高脂饲料喂养1个月，诱导其产生胰岛素抵抗，然后给予(35 mg/kg)的链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）腹腔注射，破坏胰岛细胞诱导糖尿病的发生，此模型很好的模拟了人T2DM的发病过程及代谢特点。对成功诱导的T2DM大鼠随机分组后分别进行DJB手术及假手术(Sham-DJB，S-DJB)，并设置空白对照组(CON)，检测以下指标:(1)血糖:每周检测其空腹血糖;(2)糖耐量:术后进行口服葡萄糖耐量实验(Oral glucosetolerance test，OGTT);(3)胰岛素敏感性:术后进行胰岛素耐量实验(Insulintolerance test，ITT);(4)胰岛素水平:术后检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平;(5)肠道激素:术后检测胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）、肽YY（Peptide YY，PYY）及葡萄糖依赖性促胰岛素肽(Glucose dependentinsulinotropic peptide，GIP);(6)血脂及肝功指标:检测术后血清甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸水平及ALT和AST。(7)术后血清胆汁酸水平及其与血糖、胰岛素及肠道激素的相关性分析。
　　结果：
　　(1)高脂饮食联合小剂量STZ可成功诱导T2DM大鼠模型
　　(2) DJB组大鼠术后的体重及能量摄入与S-DJB组、CON组比较与均无统计学差异(*P＞0.05)。
　　(3)与S-DJB组比较，DJB组术后空腹血糖迅速下降至正常水平，S-DJB组大鼠的空腹血糖逐步升高。
　　(4)与S-DJB组比较，DJB组术后2周糖耐量明显改善（AUCoGTT明显下降，*P＜0.05）。
　　(5)相比S-DJB组，DJB组大鼠术后2周胰岛素敏感性有明显改善(AUCITT明显下降，*P＜0.05);在术后4周DJB组大鼠胰岛素敏感性有一定的上升，但两组大鼠的AUCITT差异仍然显著。
　　(6) DJB组大鼠术后第2周、16周葡糖糖刺激的胰岛素分泌水平与S-DJB组和CON组比较显著升高（*P＜0.05）。
　　(7)与S-DJB组比较，DJB组大鼠术后2周及16周葡糖糖刺激后GLP-1、PYY水平明显升高（*P＜0.05）。
　　(8) DJB组术后甘油三酯及游离脂肪酸(FFA)水平较S-DJB组大鼠显著降低(*P＜0.05)。
　　(9)与S-DJB组比较，DJB术后大鼠的血清胆汁酸水平显著升高，且胆汁酸变化与胰岛素水平、及肠道激素GLP-1水平呈显著正相关，与空腹血糖变化存在显著负相关。
　　结论：
　　(1)通过高脂饲料喂养及联合STZ(35 mg/kg)可以成功诱导T2DM大鼠模型;
　　(2) DJB可迅速、有效、持久的改善T2DM大鼠的空腹血糖;
　　(3) DJB能有效改善T2DM大鼠的糖耐量及胰岛素敏感性;
　　(4) DJB能明显提高葡萄糖刺激后的GLP-1、PYY的分泌，但对GIP的分泌量无明显影响;
　　(5) DJB能有效降低T2DM大鼠模型的FFA及甘油三酯水平;
　　(6) DJB可导致血清胆汁酸浓度显著升高，且胆汁酸变化与血糖、胰岛素、及肠道激素变化存在显著相关性。
　　该部分实验结果表明，DJB能有效改善T2DM大鼠模型的糖代谢，并观察到肠道激素GLP-1、PYY水平的升高及血清胆汁酸水平升高。且胆汁酸升高水平与糖代谢指标和肠道激素水平变化具有相关性。我们推测DJB可能是通过某种与胆汁酸相关途径影响GLP-1、PYY等肠道激素水平的变化，从而最终改善T2DM大鼠模型的糖代谢。在下一步的研究中，我们将对其作用机制进行进一步的研究。
　　第二部分 十二指肠空肠旁路术后T2DM大鼠胆汁酸水平升高机制的研究
　　目的：
　　前期实验已证实DJB术后机体的血液中胆汁酸浓度升高，而且胆汁酸浓度升高与糖代谢的改善呈正相关。血液中胆汁酸浓度升高可以激活肝脏和肠道的胆汁酸感受器促进肝脏糖原合成、抑制糖异生，在调节胰岛素敏感性方面发挥着至关重要的作用，但胆汁酸升高的原因目前尚未清楚，为明确其升高原因，我们在本部分研究中对末端回肠的胆汁酸转运体和肝脏中胆汁酸合成的关键酶的蛋白表达进行检测，从胆汁酸的合成和重吸收两个方面进行研究，以明确DJB术后血庆胆汁酸升高的具体机制。
　　方法：
　　应用第一部分实验中取得的组织样本，以Western blot技术对DJB术后肝脏组织中胆固醇关键合成酶-胆固醇7a-羟化酶(CYP7A1)、氧化甾醇27a羟化酶(CYP27A1)的表达进行检测;以免疫组化技术对回肠末端组织中胆汁酸主要转载体钠依赖性胆汁酸转运体(ASBT)及回肠胆汁酸结合蛋白(IBABP)的表达进行检测。
　　结果：
　　(1)与S-DJB组相比，DJB组肝脏组织中CYP27A1表达有所下降，但并未达到显著性差异(P＞0.05)，CYP7A1的表达无明显变化(P＞0.05)。
　　(2)与S-DJB组相比，DJB组大鼠回肠末端组织中ASBT和IBABP表达显著升高（*P＜0.05）。
　　结论：
　　本部分的实验结果表明:
　　(1)DJB手术后T2DM大鼠肝脏组织中胆汁酸合成酶表达无明显变化，证明胆汁酸的升高并不是因为胆汁酸合成的增加引起的。
　　(2)DJB手术后T2DM大鼠回肠末端的胆汁酸转运体以及胆汁酸结合蛋白表达量均增加，证明胆汁酸在回肠的重吸收增加。
　　DJB术后血清胆汁酸水平升高并不是合成增加，而是重吸收增加的结果。
　　第三部分 十二指肠空肠旁路术后胆汁酸升高对糖代谢影响机制的研究
　　目的：
　　我们在前期实验中已证实DJB术后机体的血液中胆汁酸浓度升高，而且胆汁酸浓度升高与糖脂代谢有相关性。胆汁酸浓度升高可以激活肠-肝循环的胆汁酸感受器促进肝脏糖原合成、抑制糖异生，在调节胰岛素敏感性及影响糖脂代谢方面发挥着至关重要的作用。为验证DJB术后通过胆汁酸升高进一步改善糖代谢的理论，我们在本部分研究中对肝脏和回肠的FXRα、TGR-5蛋白表达进行检测，同时对肝脏糖原合成和糖异生的关键酶PEPCK、G6Pase表达水平进行检测。以明确DJB术后胆汁酸浓度升高影响糖脂代谢的可能机制。
　　方法：
　　应用第一部分中取得的组织样本，以免疫组化技术对DJB术后肝脏和回肠组织中FXRα的表达、肝脏组织中TGR-5的表达进行检测;以Western blot对磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)表达水平进行检测。
　　结果：
　　(1)与S-DJB组相比，DJB组大鼠末端回肠组织中FXRα表达显著增加，而肝脏组织中FXRα的表达仅轻度增加;
　　(2)与S-DJB组相比，DJB组大鼠肝脏组织中TGR-5表达显著增加;
　　(3)与S-DJB组比较，肝脏组织中的PEPCK和G6Pase表达增加，有显著统计学差异。
　　结论：
　　本部分的实验结果表明:
　　(1) DJB组术后与S-DJB组相比，T2DM大鼠末端回肠组织中FXRα表达显著增加，肝脏组织中FXRα表达轻度增加，而肝脏组织中的PEPCK和G6Pase基因表达水平升高，表明胆汁酸改善糖脂代谢可能与肠道内胆汁酸-FXRα-FGF-19/15通路相关。
　　(2) DJB手术后T2DM大鼠肝脏组织的TGR-5表达量增加，证明胆汁酸改善糖代谢可能是通过胆汁酸-TGR-5-GLP-1通路实现的.

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 T2DM大鼠及十二指肠-空肠旁路术模型的建立及评价

前言

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

4 结论

附表

附图

参考文献

第二部分 十二指肠空肠旁路术后T2DB大鼠胆汁酸水平升高机制的研究

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

附图

参考文献

第三部分 十二指肠空肠旁路术后胆汁酸升高对糖代谢影响机制的研究

前言

1 材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

附图

参考文献

致谢

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