选择性脾酪氨酸激酶抑制剂P505-15与类风湿性关节炎的相关性研究

摘要

背景：
　　类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以对称性、多关节炎为主要临床表现的慢性、进行性、系统性、自身免疫性疾病，全身多发关节受累。RA是一种复杂的退行性疾病，其发病过程中涉及到大量炎性和非炎性细胞。RA可反复迁延多年，关节内滑膜组织过度增殖，形成血管翳，对关节软骨、骨以及韧带的造成渐进性侵袭性破坏，最终将导致关节强直、畸形及关节功能丧失，致重度残疾，对人类健康的危害极大。基于对RA的发病机制以及相关的细胞和分子的病理生理研究发现，脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase，Syk)在RA的发病机制中起着关键性的作用。Syk是一个下游信号传导因子级联反应激活的主要调节酶，在自身抗体的产生过程中，以及在多种内在免疫效应因子的作用中，具有无可替代的中心作用。免疫细胞在RA的发病过程中，也发挥至关重要的作用，而Syk也是这些免疫细胞活化的中心环节，在这些细胞的信号转导过程中发挥重要作用。Syk在RA发病及病情进展中发挥着诸多重要作用，这使得Syk抑制剂成为RA治疗的非常有前景的候选药物。众多制药和生物技术公司对抑制剂表现出了浓厚的兴趣。目前针对RA治疗和其他一些适应症的许多Syk小分子抑制剂正处在不同研发阶段。p505-15是一种新型的、高度选择性Syk抑制剂，相对于其它一些小分子Syk抑制剂，p505-15还没有被系统的深入研究过。
　　目的：
　　通过分子生物学、细胞学及动物实验、体内/体外实验等多个方面，系统的探讨p505-15对Syk抑制作用的高效性、高特异性，对CIA发病及病情发展的有效抑制。
　　方法：
　　通过SUDHL4细胞株，利用蛋白印迹分析法检测BCR介导的BLNK的磷酸化，测定Syk的活性;检测BCR介导的Syk的磷酸化，测定Lyn的活性;验证p505-15抑制Syk的特异性。人的全血在抗-BCR或PMA刺激后诱导SYK依赖的或非依赖的信号系统和B细胞的功能性活化，使用流式细胞仪检测细胞活化程度验证p505-15特异性抑制Syk依赖的白细胞信号系统的转导和B细胞的激活。将口服p505-15给药后的小鼠血液通过磷酸化流式细胞仪测量Syk活性验证p505-15在体内抑制Syk的高效性及可逆性。建立小鼠CIA模型，通过CIA小鼠关节炎指数评分、后踝关节肿胀程度以及CIA小鼠关节组织HE染色切片观察关节形态学变化、番红O关节软骨染色、关节滑膜组织巨噬细胞浸润，并使用免疫组化方法测定血清抗-CII IgG1和IgG2a及血清TNF-α、IL-6和IL-17水平等方法验证p505-15抑制CIA小鼠关节炎的发病、发展及相关炎性因子的产生。通过获取分离培养的原代人RA滑膜细胞，检测其分泌TNF-α，IL-6和IL-17的水平，验证p505-15可抑制人RA促炎性反应从而削弱自身免疫性关节炎的发病。
　　结果：
　　1、在SUDHL4细胞株，各不同浓度的p505-15均抑制了BLNK Tyr84的磷酸化，提示Syk活性得到抑制，并显示了明显的浓度依赖性;而Lyn活性在试验中的各种p505-15浓度下均没有观察到相应的抑制。Syk半数最大抑制所需要的p505-15浓度在0.16-0.4uM之间。
　　2、在人的全血中，p505-15抑制了Syk信号系统介导的ERK Tyr204的磷酸化(pERK Tyr204;均值IC50±SEM，0.27um±0.02)和白细胞的激活(CD69;均值IC50±SEM，0.28um±0.03)，但没有抑制Lyn依赖的信号系统介导的Syk Y352的磷酸化(pSyk Y352)。
　　3、小鼠予以p505-1515mg/kg bid的口服剂量后，给药2小时至6小时期间观察到Syk的活性被抑制超过50％，其中在服药后3小时Syk的活性抑制最大，为80％左右;6小时以后Syk活性逐渐恢复，至24小时Syk活性恢复至80％以上。在整个实验过程中没有观察到Lyn活性抑制。
　　4、成功获取小鼠CIA模型，小鼠关节炎指数评分在第28-30天时急剧升高，之后趋于平缓，于实验的第36天基本达到顶峰，AI最高计分为9.2±0.7。CIA小鼠后踝关节最肿胀处厚度均随时间延长而增加，至第32天时趋于平缓，于初次免疫后第36天达到顶峰，最高值为42±2％。口服p505-15的小鼠较口服赋形剂的空白对照组小鼠的足爪红肿程度明显减轻，关节炎指数明显降低。足爪肿胀最大减轻20％，AI值最大降低3.4，统计学显示P＜0.01。
　　5、HE染色显示口服赋形剂的空白对照组CIA小鼠的关节有明显的慢性滑膜炎，关节及滑膜层增生，滑膜翳形成，关节内中性粒细胞浸润和纤维蛋白形成，周围基质中的原始中性粒细胞浸润;在口服p505-15的治疗组CIA小鼠的关节结构基本完好，炎性细胞浸润和骨侵蚀明显被抑制。HE染色骨侵蚀组织学评分显示口服赋形剂的空白对照组CIA小鼠评分为2.9±0.4，口服p505-15的治疗组CIA小鼠评分为1±0.1，统计学显示P＜0.01，表明具有显著性差异。
　　6、番红O染色显示口服赋形剂的空白对照CIA小鼠的关节表现出明显的软骨破坏，关节内的透明软骨表面不规则，提示软骨缺失，软骨潮线的缺失和软骨细胞固缩;而在口服p505-15治疗组的CIA小鼠这一现象明显减轻，相当于正常透明软骨的各级透明软骨显示清晰。关节软骨侵蚀组织学评分显示，口服赋形剂的空白对照CIA小鼠评分为2.7±0.2，口服p505-15治疗组的CIA小鼠评分为1.3±0.1，P＜0.01表明具有显著性差异。
　　7、免疫组化分析滑膜组织切片中CD68的表达检测滑液的巨噬细胞浸润显示在口服p505-15的治疗组CIA小鼠的切片CD68表达较赋形剂的空白对照组CIA小鼠明显降低。CD68评分分别为0.8±0.1和3.1±0.3，P＜0.01，表明具有显著性差异。
　　8、免疫组化方法测定血清抗-CII IgG1和IgG2a，结果显示与口服赋形剂的空白对照组CIA小鼠相比较，口服p505-15的治疗组CIA小鼠所有的抗-CII抗体皆有显著的降低，统计学显示p＜0.01，表明具有显著性差异。
　　9、使用免疫组化方法予以测定血清TNF-α、IL-6和IL-17水平显示口服p505-15小鼠的三种炎性因子水平有显著下降，统计学显示p＜0.01，表明具有显著性差异。
　　10、获取分离培养的原代人RA滑膜细胞，使用20ng/mlIL-1β处理后取上清液行TNF-α，IL-6和IL-17测定。数据显示p505-15处理显著的降低了TNF-α，IL-6和IL-17水平，提示p505-15抑制促炎性反应。
　　结论：
　　Syk是许多免疫系统的疾病的重要的治疗靶点。p505-15是高度特异性的和有效的小分子抑制剂，细胞实验和体内实验均显示Syk具有强效的免疫调节活性。在控制炎症性疾病的免疫功能，使用p505-15对Syk的特异性抑制是一个有效的且安全可靠的可选方案。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 前言

第二部分 材料和方法

第三部分 结果

第四部分 讨论

第五部分 结论

附图

参考文献

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