Warburg效应在糖尿病结直肠癌发生风险评价及二甲双胍抑制效应中的作用研究

摘要

背景：
　　结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在西方发达国家，其发病率和死亡率在恶性肿瘤中均居第2位，并呈上升趋势。流行病学研究发现2型糖尿病与结直肠癌的发生发展密切相关，糖尿病可增加结直肠癌的发病风险。但目前关于二者的关系研究还处于流行病学阶段，尚无可靠的实验数据证实糖尿病可增加患结直肠癌的发病风险，关于糖尿病增加结直肠癌发病风险的机制尚不清楚。
　　二甲双胍是一种双胍类口服降糖药物，属于治疗2型糖尿病的一线首选药物。流行病学研究发现2型糖尿病患者服用二甲双胍能明显降低糖尿病并发结直肠癌的发病风险。但对于二甲双胍抑制糖尿病合并结直肠癌的作用机制尚不清楚。
　　糖的有氧氧化和无氧酵解是机体组织细胞获取能量的主要方式。在有氧条件下，正常细胞主要通过线粒体内的柠檬酸循环和氧化磷酸化产生ATP。但在快速增长的肿瘤细胞中，即使在氧气充足的条件下，糖无氧酵解的速率与正常细胞相比明显增高，这种现象被称为Warburg效应。代谢异常是糖尿病患者的主要特征，推测糖尿病患者在代谢失衡的状态下可能会产生Warburg效应，从而促进了肿瘤的发生。因此阐明Warburg效应在糖尿病合并结直肠癌的发生发展以及二甲双胍对糖尿病合并结直肠癌的预防作用中的作用及机制，对糖尿病合并结直肠癌的预防和治疗具有重要意义。
　　本研究拟通过动物实验，评价糖尿病合并结直肠癌的发病风险以及二甲双胍对糖尿病合并结直肠癌的预防作用，并探讨Warburg效应在糖尿病合并结直肠癌的发生发展以及二甲双胍降低糖尿病合并结直肠癌的发病风险中的作用机制，为糖尿病合并结直肠癌的预防和治疗以及临床用药提供理论依据。
　　目的：
　　1、采用高糖高脂饲料联合低剂量链脲佐菌素(STZ)诱导大鼠2型糖尿病模型。然后用二甲基肼(DMH)在正常大鼠以及糖尿病大鼠中分别诱导结直肠癌，评价糖尿病对DMH诱导的大鼠结直肠肿瘤的敏感性的影响，并检测结肠组织中与糖代谢相关的酶的活性变化，探讨Warburg效应在糖尿病合并结直肠癌的发生与发展中的作用。
　　2、用二甲双胍(MET)处理DMH诱导的大鼠结直肠癌模型，观察二甲双胍对DMH诱导大鼠结直肠肿瘤形成情况的影响，并检测二甲双胍对结肠组织中糖代谢相关酶的表达以及活性的影响，探讨Warburg效应在二甲双胍降低糖尿病合并结直肠癌的发病风险中的作用。
　　方法：
　　第一部分：
　　将SD大鼠随机分成4组:A、正常组(Control);B、糖尿病组(STZ);C、肿瘤组(DMH);D、糖尿病+肿瘤组(STZ+DMH)。高糖高脂饲料饮食联合低剂量链脲佐菌素(STZ)诱导大鼠2型糖尿病模型，然后用DMH诱导大鼠结直肠癌。检测各组异常隐窝病灶(ACF)的形成，肿瘤的数量、体积以及肿瘤发生率，组织细胞的增殖能力以及结肠组织中糖代谢相关酶的活性。
　　第二部分：
　　体内实验:将SD大鼠随机分为5组:A、正常组(Control);B、糖尿病组(STZ);C、糖尿病+肿瘤组(STZ+DMH);D、糖尿病+二甲双胍组(STZ+MET);E、糖尿病+肿瘤+二甲双胍组(STZ+DMH+MET)。高糖高脂饲料饮食联合低剂量STZ诱导大鼠2型糖尿病模型，然后用DMH诱导大鼠结直肠癌，同时给以MET灌胃处理。检测各组ACF的形成，肿瘤的数量、体积、肿瘤发生率以及MET的肿瘤抑制率，组织细胞的增殖能力，结肠组织中糖代谢相关酶的表达以及酶活性。
　　体外实验:培养人结肠癌细胞株LoVo以及HT-29，用不同浓度的MET分别处理两种细胞，MTT法检测MET对细胞增殖的抑制作用，Western Blot检测MET对细胞中糖代谢相关酶表达的影响;然后用MET处理细胞不同的时间，进行同样的检测。
　　结果：
　　第一部分：
　　1、血清学分析表明，经高糖高脂饲料饮食联合低剂量STZ处理一定时间后，大鼠血糖水平升高，胰岛素水平升高，产生胰岛素抵抗，说明2型糖尿病大鼠模型诱导成功。
　　2、诱导肿瘤中期，检测发现DMH组、STZ+DMH组大鼠结肠组织中均有ACF形成，而Control组、STZ组均无ACF形成。并且STZ+DMH组中ACF总数量以及由不同隐窝数构成的ACF数量均明显高于DMH组。
　　3、诱导肿瘤末期，DMH组、STZ+DMH组大鼠结肠组织中均有肿瘤形成，Control组、STZ组均无肿瘤形成。STZ+DMH组无论肿瘤数量、体积以及肿瘤发生率均明显高于DMH组。
　　4、免疫组化检测大鼠结肠组织细胞增殖能力，DMH组以及STZ+DMH组的肿瘤组织中PCNA表达均高于Control组以及STZ组正常组织。STZ+DMH组与DMH组相比PCNA表达明显升高，并且STZ组明显高于Control组。
　　5、DMH组、STZ+DMH组的肿瘤组织中己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)酶活均明显高于STZ组与Control组正常组织，并且STZ+DMH组与DMH组相比明显升高，但是丙酮酸脱氢酶(PDH)酶活明显降低。STZ组与Control组相比，HK、PK活性均增高，PDH活性降低。
　　第二部分：
　　1、诱导肿瘤中期，STZ+DMH组、STZ+DMH+MET组大鼠结肠组织经检测均有ACF形成，并且STZ+DMH+MET组无论ACF总数以及由不同隐窝构成的ACF数量均明显低于STZ+DMH组。其他三组均未检测出ACF的形成。
　　2、诱导肿瘤末期，STZ+DMH组、STZ+DMH+MET组结肠组织中均有肿瘤形成，联合MET处理后肿瘤数量、体积以及肿瘤发生率与STZ+DMH组相比均明显降低。其他三组均未发现肿瘤形成。
　　3、免疫组化检测PCNA在大鼠结肠组织细胞中的表达，统计分析表明STZ+DMH组、STZ+DMH+MET组肿瘤组织中PCNA的表达量均明显高于其他三组正常结肠组织，且与STZ+DMH组相比，STZ+DMH+MET组PCNA的表达明显降低;另外，STZ组PCNA表达量明显高于Control组以及STZ+MET组。Western blot检测结果与其一致。
　　4、免疫组化检测大鼠结肠组织中PKM2以及IDH1的表达，统计分析显示STZ+DMH组、STZ+DMH+MET组中肿瘤组织PKM2的表达与其他三组正常结肠组织相比明显升高，且STZ+DMH+MET组PKM2的表达低于STZ+DMH组，但IDH1的表达与其他三组比较明显下降，STZ+DMH+MET组IDH1的表达高于STZ+DMH组。Western blot检测结果与其一致。
　　5、STZ+DMH组以及STZ+DMH+MET组大鼠结肠肿瘤组织中HK活性与其他三组正常结肠组织相比明显升高，但PDH活性降低，表明肿瘤组织中糖酵解速率升高。
　　6、MET处理结肠癌细胞LoVo及HT-29后，细胞的增殖能力均明显下降，细胞中PKM2的表达升高，IDH1的表达降低，HK的活性明显升高，PDH的活性明显降低，并对MET的处理浓度以及处理时间有依赖性。
　　结论：
　　一、在相同的诱癌条件下，糖尿病大鼠的结直肠癌发病率与正常大鼠相比明显增高。由于糖尿病导致的糖代谢途径相关关键酶活性的改变，细胞增殖能力增加，组织细胞中糖酵解的速率增高，为细胞的快速增殖提供了充足的底物以及适宜的微环境，提高了组织细胞对化学诱癌剂的敏感性，从而增加了结直肠癌的发病风险;
　　二、二甲双胍作为治疗糖尿病的药物，能明显降低糖尿病合并结直肠癌的发病风险;二甲双胍可通过改变糖代谢途径相关关键酶的表达，调节酶的活性，抑制Warburg效应、降低糖酵解速率，矫正糖代谢的异常失衡，对糖尿病合并结直肠癌的发生起到预防作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 糖尿病合并结直肠癌的发病风险评价及Warburg效应的作用研究

实验材料

实验方法

实验结果

小结

第二部分 二甲双胍对糖尿病合并结直肠癌的预防作用及Warburg效应的作用研究

实验材料

实验方法

实验结果

小结

讨论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文