胆汁酸在十二指肠空肠旁路术改善大鼠T2DM中的作用和机制研究

摘要

本文分为以下几个部分进行探讨：
　　第一部分 胆汁酸在十二指肠空肠旁路术改善大鼠2型糖尿病中的作用
　　目的：
　　本研究以高脂饮食(HFD)联合链脲霉素(STZ)诱导的T2DM大鼠为模型，分别实施胆汁转流术(BD)、DJB术和假手术（SHAM），通过对比三种手术的效果，研究以下问题:(1)BD术能否模拟DJB手术对血清总胆汁酸的影响;(2)BD术是否具有类似DJB的手术效果;(3)胆汁酸是否在DJB改善T2DM的过程中起关键作用。
　　方法：
　　本研究中，我们使用HFD/STZ诱导的方法建立了T2DM大鼠模型，并将所有大鼠分为3组，每组10只，分别接受BD术，DJB术和SHAM术。BD术中，我们使用自制的胆汁转流管，在不改变肠道结构的前提下，直接将大鼠胆总管内的胆汁转流到与DJB术中空肠-空肠吻合位置相同的远端空肠，模拟DJB手术对胆汁流向的影响。术后常规记录大鼠进食量和体重，并在术后2周和8周对各组大鼠的糖脂代谢、胆汁酸、肝功、胰岛素和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)进行检测，对比三种术式的手术效果。
　　结果：
　　1.术前和术后各个时间点，DJB组与SHAM组大鼠体重无差别(P＞0.05)。术后8周，BD组大鼠体重低于SHAM组（P＜0.05），但与DJB组相比无统计学差异。各组大鼠在进食量方面无差别(P＞0.05)。
　　2.术前各组大鼠的空腹血糖和胃内葡萄糖耐量试验(IGGTT)结果无差别(P＞0.05)。术后2周和8周，DJB组和BD组大鼠空腹血糖和AUCIGGTT均显著下降，明显低于SHAM组(P＜0.05)。术后8周，BD组空腹血糖和AUCIGGTT水平高于DJB组(P＜0.01)。
　　3.术后2周，空腹和餐后血清总胆固醇水平在三组间无显著差异（P＞0.05）。BD组空腹和餐后甘油三酯与游离脂肪酸水平显著低于SHAM组和DJB组(P＜0.05)，SHAM组和DJB组间无显著差异(P＞0.05)。术后8周，各组血清总胆固醇和游离脂肪酸水平无进一步变化。DJB组空腹和餐后甘油三酯水平下降，显著低于SHAM组（P＜0.05）。
　　4.术后SHAM组与BD组HOMA-IR无显著差别(P＞0.05)，而DJB组HOMA-IR在术后2周和8周均显著低于SHAM组和BD组(P＜0.05)。
　　5.术后2周，各组大鼠GLP-1分泌无显著差别(P＞0.05)。术后8周，BD组和DJB组GLP-1分泌增强，显著高于SHAM组(P＜0.05)。
　　6.术后2周，BD组大鼠血清总胆汁酸水平显著高于SHAM组(P＜0.05);DJB组总胆汁酸水平亦高于SHAM组，但尚未达到显著统计学差异(P=0.10);BD组与DJB组间无明显差别(P＞0.05)。术后8周，SHAM组总胆汁酸水平无变化，DJB组和BD组进一步升高，显著高于SHAM组(P＜0.05)，两组间比较无差别（P＞0.05）。
　　7.术后2周，血清ALB、ALT、AST和TBIL在各组间无显著差异(P＞0.05)。血清ALP水平在DJB组和BD组较低(P＜0.05)，但两组间无显著统计学差异（P＞0.05）。术后8周，DJB组血清ALT、AST和ALP均低于SHAM组(P＜0.05)。BD组血清AST和ALP亦低于SHAM组(P＜0.05)，但其ALP高于DJB组(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.BD手术可以在T2DM大鼠模型上模拟DJB手术对胆汁酸的影响，引起血清总胆汁酸水平的显著升高。
　　2.BD手术可以改善T2DM大鼠的糖代谢，但其效果逊于DJB手术。
　　3.胆汁酸在DJB手术改善T2DM中发挥重要作用，但其他相关因素（如近端小肠脂质感受机制、肠促激素等）可能也是DJB手术改善T2DM的重要机制。
　　第二部分 十二指肠空肠旁路术对大鼠血清胆汁酸谱及肠道菌群的影响
　　目的：
　　本研究以HFD/STZ诱导的T2DM大鼠为模型，实施DJB手术，并与假手术组对比，研究以下问题:(1)DJB术后血清胆汁酸谱的变化;(2)DJB术后肠道菌群的改变。
　　方法：
　　本研究中，我们将STZ/HFD诱导的T2DM大鼠分为2组，每组10只，分别接受DJB术和假手术(SHAM)。于术后2周和12周评估手术效果，并使用高效液相色谱串联质谱技术（HPLC-MS/MS）对血清胆汁酸谱进行分析;使用Illumina MiSeq高通量测序平台对粪便中的菌群进行分析，明确DJB手术对血清胆汁酸谱和肠道菌群的影响。
　　结果：
　　1.术前，DJB组和SHAM组大鼠的体重、进食量和IGGTT结果均无显著差别（P＞0.05）。术后11周和12周，SHAM组大鼠进食量显著高于DJB组(P＜0.05)。术后2周和12周，DJB组大鼠血糖出现明显改善，并伴有胰岛素敏感性的升高和GLP-1分泌的增强。两组大鼠在术后胰岛素分泌、体重方面无差别(P＞0.05)。
　　2.DJB组大鼠在回肠末段和结肠肠腔内的总胆汁酸浓度均高于SHAM组(P＜0.05)。术后DJB组和SHAM组大鼠粪便总胆汁酸浓度无差别。术后2周和12周，DJB组血清总胆汁酸浓度均显著高于SHAM组（P＜0.01）。
　　3.手术后，胆酸(CA)占SHAM组大鼠血清胆汁酸总量的50％以上，而在DJB组的比例不足40％。术后2周，SHAM组和DJB组大鼠血清胆汁酸谱的组成无显著统计学差异(P＞0.05)。术后12周，除牛磺脱氧胆酸(TDCA)和牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)外，DJB组所有牛磺酸结合型胆汁酸的比例均显著高于SHAM组(P＜0.05)。
　　4.大鼠粪便菌群主要由拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门构成，占总量的90％以上。术后，SHAM组大鼠以拟杆菌门为主，而DJB组以厚壁菌门和变形菌门为主。当错误发现率设定在5％时，与SHAM组相比，DJB组拟杆菌门的数目在术后2周和12周均显著低于SHAM组(P＜0.05);术后2周，DJB组厚壁菌门的数目显著高于SHAM组(P=0.019)。其他菌门在两组间无显著差异(P＞0.05)。当错误发现率设定在25％时，DJB组厚壁菌门的数目在术后2周和12周均显著高于SHAM组(P=0.019，P=0.186)。术后2周，DJB组变形菌门的数目也显著高于SHAM组(P=0.186)。
　　5.术后12周，结肠内总胆汁酸水平与粪便中拟杆菌门的数目呈负相关(r=-0.73，P＜0.001)，与粪便中变形菌门的数目呈正相关(r=0.62，P＜0.001)。
　　结论：
　　1.DJB术后，T2DM大鼠的血清总胆汁酸水平显著升高，且以牛磺酸结合型胆汁酸的升高为主。
　　2.DJB术后T2DM大鼠的肠道菌群出现改变，厚壁菌门和变形菌门数目上升，拟杆菌门数目下降。
　　3.DJB术后T2DM大鼠肠道菌群和胆汁酸的改变可能是两者相互作用、相互影响的结果。
　　第三部分 十二指肠空肠旁路术影响大鼠胆汁酸代谢的机制
　　目的：
　　本研究的主要目的是探索DJB对胆汁酸代谢的影响，进而明确DJB术后血清总胆汁酸水平升高、牛磺酸结合型胆汁酸增多的分子生物学机制。
　　方法：
　　本研究利用第二部分研究留存的肝脏和肠粘膜标本，通过Western Blot技术检测肝脏内胆汁酸合成关键酶CYP7A1、CYP27A1和CYP8B1的蛋白表达水平，以及催化胆汁酸与氨基酸结合的关键酶BACS和BAAT的蛋白表达水平;通过RT-PCR技术检测胆汁酸肠肝循环通路上胆汁酸转运体(BSEP、NTCP、ASBT、ILBP、OSTα)及FXR、SHP的mRNA表达水平。
　　结果：
　　1.术后12周，DJB组大鼠肝脏胆汁酸合成关键酶CYP7A1的表达水平显著低于SHAM组（P＜0.05）;CYP27A1、CYP8B1的表达水平在SHAM组和DJB组之间无显著统计学差异(P＞0.05)。
　　2.术后12周，DJB组大鼠肝脏内催化胆汁酸与氨基酸结合的关键酶BACS和BAAT的表达水平显著高于SHAM组(P＜0.05)。
　　3.术后12周，DJB组大鼠肝细胞表面胆汁酸转运体NTCP和BSEP的mRNA表达水平与SHAM组无差别(P＞0.05);回肠粘膜细胞胆汁酸转运体ASBT、ILBP及OSTα的表达水平显著高于SHAM组(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.DJB术后，T2DM大鼠肝脏内胆汁酸合成关键酶CYP7A1的表达下降，回肠粘膜细胞内ASBT、ILBP及OSTα的mRNA表达上升，说明DJB术后大鼠胆汁酸合成减少，血清总胆汁酸水平上升是肠道内胆汁酸重吸收增加的结果。
　　2.DJB术后，T2DM大鼠肝细胞内影响胆汁酸与氨基酸结合的关键酶BACS及BAAT的表达上升，说明DJB术后大鼠体内牛磺酸与胆汁酸的结合更加活跃。
　　3.DJB术后，T2DM大鼠肝脏FXR和SHP的mRNA表达均有上升趋势，而回肠FXR的mRNA表达下降，SHP无明显变化。说明胆汁酸合成减少可能是肝脏“FXR-SHP”通路被激活、负反馈调节的结果。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 胆汁酸在十二指肠空肠旁路术改善大鼠2型糖尿病中的作用

背景

材料和方法

结果

结论

结论

参考文献

附图

第二部分 十二指肠空肠旁路术对大鼠血清胆汁酸谱及肠道菌群的影响

背景

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

第三部分 十二指肠空肠旁路术影响大鼠胆汁酸代谢的机制

背景

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

致谢

攻读学位期间发表论文及获奖情况

学位论文评阅及答辩情况表

英文文章1

英文文章2