Gaspase-1抑制剂对实验性自身免疫性重症肌无力的影响与机制研究

摘要

本文分为两个论文进行探讨：
　　论文Ⅰ Caspase-1抑制剂通过抑制内源性树突状细胞-白介素-1-白介素-17途径改善实验性自身免疫性重症肌无力
　　目的:
　　探讨caspase-1抑制剂影响实验性自身免疫性重症肌无力的细胞免疫学机制。
　　方法:
　　1.建立EAMG模型及临床分级
　　选择健康的雌性Lewis大鼠，一般6-8周龄，体重160-180 g。用H37Ra株热灭活结核杆菌和不完全弗氏佐剂溶解人工合成的大鼠来源的AChRα亚基97-116肽段(R97-116)，首先每只大鼠在双后足垫皮下注射免疫剂量200μl，然后首次免疫11天后在每只大鼠背部再次免疫1次，作为强化免疫。每间隔一天采用Lennon临床评分量表对每只大鼠进行临床分级和称重，这个过程需要采用双盲法。
　　2.动物分组分别设立caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk治疗组、caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk+IL-1β治疗组和EAMG对照组。于第一次免疫后的第13天和第14天分别给予腹腔注射Ac-YVAD-cmk和IL-1β及等体积的灭菌PBS，观察症状直至发病高峰期。
　　3.制备脾脏、骨髓DC及检测
　　通过无菌操作分离、摘取Lewis大鼠的脾脏，在超净台中研磨脾脏组织，过滤、离心获取单个核细胞悬液。用裂解液破坏细胞悬液中的红细胞，离心、冲洗后将细胞悬液转移至培养瓶中，于37℃、5％ CO2条件下培养1 h40 min，平晃培养瓶，使悬浮细胞离壁，弃掉其内液体，冲洗并留取贴壁细胞，加入完全培养液继续培养18h，最后悬浮的细胞即是脾脏树突状细胞。同样的取Lewis大鼠的股骨和胫骨，制备单细胞悬液，加入10 ng/ml GM-CSF和10 ng/ml IL-4培养8天后收集悬浮的树突状细胞。向培养瓶中加入LPS和Ac-YVAD-cmk（终浓度8μM），对照培养瓶中加入等体积的LPS和溶剂DMSO，培养48 h后收集悬浮的细胞。最后为了验证Ac-YVAD-cmk对DCs作用，分别检测两组DCs表面共刺激分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达及其胞内细胞因子IL-1β的水平。
　　4.制备淋巴结单个核细胞(mononuclear cells，MNC)
　　在EAMG大鼠发病高峰期，无菌操作下分离、获取各组大鼠腹股沟淋巴结，通过研磨过滤、离心，制备MNC悬液，并用细胞计数板计数，通过计算，最终获取细胞浓度为2×106个细胞/ml的细胞悬液。
　　结果:
　　1.体外试验中两组大鼠DCs表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ和IL-1β分子的表达情况在体外试验中，与DMSO对照组相比，caspase-1抑制剂治疗组脾脏DCs低表达CD86、MHC-Ⅱ和IL-1β分子，而且caspase-1抑制剂治疗组骨髓DCs低表达CD80、CD86和IL-1β分子。
　　2.Caspase-1抑制剂可以缓解EAMG大鼠疾病进展并调节其DCs表面分子与EAMG对照组相比，caspase-1抑制剂治疗组EAMG大鼠临床症状明显缓解。Caspase-1抑制剂治疗对EAMG大鼠血清中抗R97-116 IgG抗体的水平无明显影响，但是降低了抗R97-116 IgG抗体的亲和性。经流式检测发现，caspase-1抑制剂可以降低EAMG大鼠MNC中OX62+DC表面CD86、MHCⅡ分子的表达。
　　3.外源性IL-1β对caspase-1抑制剂治疗EAMG作用的影响
　　与caspase-1抑制剂治疗组大鼠相比较，caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组大鼠临床症状明显加重，而且caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组与EAMG组大鼠临床症状无明显差异。Caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组大鼠检测血清抗R97-116 IgG抗体的水平显著高于EAMG组和caspase-1抑制剂治疗组，而且两个治疗组血清抗R97-116 IgG抗体的亲和性均明显低于EAMG组。另外，EAMG组和caspase-1抑制剂治疗组血清抗R97-116IgG1、G2a、G2b抗体的水平无明显差异，然而caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组血清抗R97-116 IgG1、G2a水平明显高于其他两组。
　　4.Caspase-1抑制剂治疗EAMG通过抑制DC IL-1β-CD4+ T-γδT-IL-17途径与EAMG对照组相比，caspase-1抑制剂治疗组下调了OX62+ DC细胞中IL-1β阳性细胞百分比，注射IL-1β仅能够部分逆转这个结果，caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组与EAMG对照组之间没有明显差异。与EAMG对照组相比，caspase-1抑制剂治疗组减少了CD4+IL-17+细胞百分比，注射IL-1β可部分逆转但没有统计学差异。γδ T细胞数量在三组之间没有明显差异。与EAMG对照组相比，caspase-1抑制剂治疗组下调了γδ T细胞中IL-17阳性细胞百分比，但是两个治疗组之间没有明显差异。与EAMG对照组相比，caspase-1抑制剂治疗组降低了细胞培养上清中IL-1β水平，caspase-1抑制剂+IL-1β治疗组IL-1β水平较caspase-1抑制剂治疗组上调，但没有达到统计学差异。细胞培养上清中IL-17水平三组之间没有明显差异。
　　结论:
　　1.在体外实验中，caspase-1抑制剂可以通过减少IL-1β水平降低DCs表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达抑制DCs成熟。
　　2.Caspase-1抑制剂通过抑制DC IL-1β-CD4+ T-γδT-IL-17途径，降低抗R97-116 IgG抗体的亲和性，从而抑制EAMG疾病发展。
　　3.Caspase-1抑制剂可以减少CD4+CXCR5+ICOS+T细胞表达。
　　4.注射外源性IL-1β并不能逆转caspase-1抑制剂在EAMG中的作用。
　　论文Ⅱ Caspase-1抑制剂治疗实验性自身免疫性重症肌无力体液免疫的机制研究
　　目的:
　　探讨caspase-1抑制剂治疗实验性自身免疫性重症肌无力大鼠的体液免疫机制。
　　方法:
　　1.EAMG模型的制备
　　选择健康的雌性Lewis大鼠，一般6-8周龄，体重160-180 g。用H37Ra株热灭活结核杆菌和不完全弗氏佐剂溶解人工合成的大鼠来源的AChRα亚基97-116肽段(R97-116)，首先每只大鼠在双后足垫皮下注射免疫剂量200μl，然后首次免疫11天后在每只大鼠背部再次免疫1次，作为强化免疫。
　　2.动物分组
　　分别设立EAMG对照组、caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk治疗组，从第一次免疫后的第13天开始隔天给予腹腔注射Ac-YVAD-cmk，对照组给予等体积的灭菌PBS，观察症状直至发病高峰期。
　　3.通过ELISA法检测血清中抗R97-116 IgG抗体水平和亲和性在EAMG发病高峰期处死大鼠，吸取心脏血离心，获取血清，通过ELISA法检测不同组大鼠血清中抗R97-116 IgG抗体的水平和亲和性。
　　结果:
　　1.Caspase-1抑制剂可以抑制EAMG大鼠抗R97-116 IgG抗体、生发中心反应在免疫后第43天，通过ELISA法检测了对照组和治疗组大鼠血清中抗体水平，两组血清抗R97-116 IgG抗体水平没有统计学差异，但是治疗组抗R97-116 IgG抗体亲和性低于对照组。Caspase-1抑制剂治疗组生发中心PNA+B细胞低于EAMG对照组。
　　2.Caspase-1抑制剂平衡EAMG大鼠中Tfh、Tfr细胞亚群
　　结果显示，与对照组EAMG大鼠相比，caspase-1抑制剂治疗组大鼠流式检测Tfh细胞亚群减少，Tfr细胞亚群增加。
　　3.Caspase-1抑制剂可以增加EAMG大鼠调节性B细胞数量
　　结果显示caspase-1抑制剂治疗组大鼠B-Foxp3细胞数量较EAMG对照组增加，另外caspase-1抑制剂治疗组大鼠B-10细胞数量也较对照组增加，但是没有统计学差异。进一步检测了经R97-116抗原刺激细胞培养上清液中IL-10水平，结果显示caspase-1抑制剂治疗组大鼠IL-10水平较对照组增加。
　　结论:
　　1.Caspase-1抑制剂治疗可以降低EAMG大鼠抗R97-116 IgG抗体亲和性。
　　2.Caspase-1抑制剂抑制生发中心反应。
　　3.Caspase-1抑制剂减少滤泡辅助T细胞数量，增加滤泡辅助调节性T细胞和调节性B细胞数量。

目录

声明

论文Ⅰ Caspase-1抑制剂通过抑制内源性树突状细胞-白介素-1-白介素-17途径改善实验性自身免疫性重症肌无力

摘要

符号说明(按字母顺序排列)

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

论文Ⅱ Caspase-1抑制剂治疗实验性自身免疫性重症肌无力

摘要

符号说明(按字母顺序排列)

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述 Caspase-1抑制剂与相关免疫疾病的研究进展

致谢

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