实验性自身免疫性神经炎和实验性自身免疫性重症肌无力的潜在治疗靶点研究

摘要

本文主要从以下几方面进行论述：
　　论文Ⅰ 糖酵解代谢在实验性自身免疫性神经炎发病机制中的作用
　　吉兰巴雷综合征(GBS)是一种免疫介导的周围神经病。GBS的确切病因和发病机制至今尚未完全明确。大鼠实验性自身免疫性神经炎模型(EAN)是广泛应用的研究GBS发病机制和新疗法的模型。考虑到参与EAN发病的相关细胞具有活跃糖酵解代谢特点，如Th1和Th17细胞、激活的巨噬细胞和树突细胞(DC)以及Tfh细胞等都依赖糖酵解成熟和分化，因此我们假设:糖酵解代谢可能是EAN免疫建立的基础，参与了疾病病情进展;通过糖酵解抑制可以改变体内淋巴细胞、巨噬细胞等细胞的分化和功能行使，从而影响EAN病情。
　　2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose，2-DG)是葡萄糖的类似物，可竞争性抑制葡萄糖代谢，并被磷酸化为无法进一步代谢的磷酸2-DG，作为糖酵解抑制剂而广泛用于实验研究。
　　研究目的：
　　通过预防性和治疗性应用糖酵解抑制剂，观察EAN模型鼠的临床症状和体重变化，检测淋巴细胞分化、坐骨神经炎性浸润等体内免疫学变化，结合体外细胞实验来探讨糖酵解代谢在EAN发病机制中的作用。
　　研究方法：
　　1.大鼠EAN模型的构建和评分标准
　　将提取自牛马尾神经内的牛周围神经髓鞘(bovine peripheral myelin，BPM)配合弗氏佐剂、结核菌素于Lewis大鼠尾根部皮下注射进行模型构建。评分标准为:0=正常;1=尾巴张力下降;2=尾巴部分瘫痪;3=尾巴完全瘫痪或翻正反射缺失;4=步态异常;5=后肢轻度瘫痪;6=后肢中度瘫痪;7=后肢重度瘫痪;8=四肢瘫痪;9=濒死;10=死亡。
　　2.动物分组及药物干预
　　预防性给药实验中，将Lewis大鼠随机分为对照组和预防性给药组。其中给药组自免疫当天开始每日腹腔注射糖酵解抑制剂(2-DG)至免疫后第13天。治疗性给药实验中，将Lewis大鼠随机分为对照组和治疗性给药组。其中给药组自发病开始时（即免疫后第10天）开始每日腹腔注射2-DG直至恢复期（即免疫后第21天）。对各组大鼠每日称重并观察临床症状，临床评分。实验终点时采用过量异氟烷麻醉处死，收取各组大鼠血清、双侧腹股沟淋巴结、脾脏、坐骨神经。
　　3.坐骨神经组织切片评价炎性细胞浸润程度
　　收取大鼠坐骨神经，经固定、脱水、石蜡包埋、切片后，HE染色观察炎性浸润程度，并计数视野中的单个核细胞。CD68免疫组化染色观察并计数浸润的巨噬细胞数。Luxol fast blue染色观察神经脱髓鞘程度，脱髓鞘评分标准为:0=正常;1=脱髓鞘纤维少于25％;2=脱髓鞘纤维在25-50％;3=脱髓鞘纤维在50-75％;4=脱髓鞘纤维超过75％。
　　4.流式细胞术分析体内树突细胞的成熟性及淋巴细胞各亚型比例
　　收取并研磨双侧腹股沟淋巴结或脾脏，经裂解去除红细胞后，得到单个核细胞悬液。分别行CD4，CD25，OX62，MHCⅡ， CD86，CD80, CXCR5, ICOS的表面染色，行Foxp3，IFN-γ，IL-17的胞内染色。DC的成熟性以OX62+细胞上MHCⅡ、CD86和（或）CD80的表达量来确定。CD4、CD25和Foxp3抗体标记调节性T淋巴细胞(regulatory T cells，Treg)，CD4、CXCR5和ICOS抗体标记Tfh细胞。流式细胞仪上机检测。
　　5.ELISA检测体内抗BPM抗体水平
　　收取大鼠血清，用BPM包被96孔板后，ELISA方法检测各组大鼠血清中抗BPM抗体的水平。
　　研究结果：
　　1.LPS刺激增加巨噬细胞的糖酵解水平并可被2-DG所抑制
　　流式细胞术显示，LPS刺激后，腹腔巨噬细胞对荧光标记葡萄糖(2-NBDG)的摄取增加。同时，其培养基中的葡萄糖浓度和酸碱度出现明显下降，且可被2-DG所抑制。
　　2.预防性2-DG给药可阻止EAN起病并降低炎性细胞浸润
　　与对照组相比，预防性2-DG给药组大鼠发病晚、体重丢失少。两组大鼠临床评分和体重丢失在免疫后第10，11，12，13天均有显著差异。H&E染色显示，给药组坐骨神经内的炎性浸润细胞明显少于对照;同时，免疫组化染色显示，浸润的CD68阳性巨噬细胞数在给药后也有显著减少。
　　3.预防性2-DG给药改变细胞免疫和体液免疫反应
　　流式细胞术显示，2-DG的给药降低了淋巴结中Th1和Th17细胞，增加了Treg细胞。同时，脾脏DC的MHCⅡ表达量显著下降，Tfh细胞明显降低，血清中抗BPM抗体水平降低。
　　4.治疗性2-DG给药阻止EAN病情进展，减轻神经脱髓鞘程度
　　2-DG给药几乎完全阻止了EAN的病情进展，给药组的平均最高临床评分明显低于对照组，两组间差异极显著。同时，2-DG给药也显著减少了EAN大鼠的体重丢失。自免疫后第13天至第21天时，两组间大鼠体重差异显著。H&E染色显示，2-DG给药后大鼠坐骨神经内的浸润细胞数无明显差异。但LFB染色显示，2-DG的给药显著降低了坐骨神经处的脱髓鞘程度。
　　5.治疗性2-DG给药改变体内免疫反应
　　流式细胞术显示，2-DG治疗性给药后，Treg细胞数明显增加，但淋巴结中的Th1和Th17细胞并未有明显改变。同时，脾脏DC的MHCⅡ的表达水平显著下降。
　　研究结论：
　　本实验显示增强的糖酵解代谢可能参与了EAN的发病过程，而糖酵解抑制可显著阻止EAN的发病和病情进展，其潜在机制包括抑制Th1、Th17和Tfh的发育，促进Treg细胞分化，抑制DC的成熟和降低巨噬细胞的吞噬和NO分泌。因此，针对糖酵解代谢或其通路的调节有望成为GBS治疗的新策略。
　　论文Ⅱ 免疫性蛋白酶体抑制剂ONX-0914对实验性自身免疫性重症肌无力的体液免疫调节
　　实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)是MG的动物模型，是探索MG治疗靶点的可靠模型。泛素蛋白酶体通路是真核细胞中对蛋白质合成进行质量控制的主要通路。作为免疫性蛋白酶体亚单位β5i亦称低分子量多肽（LMP7）的选择性抑制剂，ONX-0914已经在类风湿性关节炎、多发性硬化、桥本氏甲状腺炎和炎性肠病等动物模型中取得了良好的治疗效果。是否ONX-0914可以缓解EAMG或MG的病情，至今尚未有研究报道。
　　研究目的：
　　通过ONX-0914治疗大鼠EAMG，观察其病情和体内免疫反应的变化，探讨免疫性蛋白酶体作为MG治疗靶点的可行性。
　　研究方法：
　　1.胸腺切片的免疫组化染色
　　MG患者胸腺石蜡切片经脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶去除等步骤，再加抗LMP7抗体孵育，经显色和苏木素复染后，观察LMP7在MG胸腺生发中心处的表达。
　　2.EAMG模型构建和临床评分
　　选择雌性6-8周龄Lewis大鼠作为模型鼠。将灭活结核菌素，不完全弗氏佐剂和大鼠AChRα97-116合成肽(R97-116)混悬液充分震荡乳化为油包水状态，于双侧尾根部皮下进行初次免疫。初次免疫30天后，行加强免疫，方法同前。加强免疫的乳液中不含结核菌素。免疫后，每隔一天参考Lennon评分进行临床评分，直至免疫后第50天。
　　3.EAMG分组和ONX-091体内给药
　　将模型鼠随机分为对照组和治疗组。自免疫后第5天开始，治疗组每隔2日给予ONX-0914静脉注射，对照组静脉注射等体积不含药溶液。
　　4.流式细胞术分析脾脏和淋巴结单个核细胞
　　处死大鼠后，迅速取出脾脏和淋巴结，经研磨、过滤和（或）红细胞裂解后，得到淋巴结、脾脏单个核细胞悬液。计数，取各样本的细胞分别行CD4，PNA， B220，OX62，MHCⅡ，CD80，CD86，CXCR5，ICOS的表面染色，行Foxp3，IFN-γ，IL-17和IL-4的胞内染色。DC的成熟性以MHCⅡ、CD80和CD86在OX62+细胞的表达来确定;调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)以CD4和Foxp3阳性为标志;Tfh细胞以CD4、CXCR5和ICOS阳性为标记。生发中心B细胞以花生凝集素(peanut agglutinin，PNA)和B220阳性为标记。染色完成后，多聚甲醛固定，流式细胞仪上机检测。
　　研究结果：
　　1.MG胸腺异位生发中心高表达免疫性蛋白酶体亚基LMP7
　　免疫组化染色显示，MG胸腺的异位生发中心相比周围组织及胸腺囊肿患者的胸腺切片，有更显著的LMP7表达。
　　2.免疫性蛋白酶体抑制剂ONX-0914缓解EAMG病情
　　给予ONX-0914静脉注射后，相比对照组，治疗组大鼠在初免后第34、38、46、48、50天时的临床症状更轻。两组临床评分具有明显统计学差异。
　　3.免疫性蛋白酶体抑制剂ONX-0914抑制抗体生成和抗体亲和力
　　ELISA显示，ONX-0914给药后，抗R97-116抗体水平在初免25天时明显降低，而加强免疫后（免疫后第35天和50天）又恢复到了对照组水平;初免50天，抗体相对亲和力明显降低。
　　研究结论：
　　ONX-0914可减少DC、MHCⅡ+细胞，抑制Th17、Tfh细胞分化，降低抗R97-116抗体的亲和力，从而减轻EAMG的病情。因此，免疫性蛋白酶体有望成为MG治疗的新靶点。

目录

声明

论文Ⅰ糖酵解代谢在实验性自身免疫性神经炎发病机制中的作用

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

论文Ⅱ 免疫性蛋白酶体抑制剂ONX-0914对实验性自身免疫性重症肌无力的体液免疫调节

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

附图

参考文献

致谢

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