缺血后处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及其分子机制

摘要

目的：
　　缺血后处理(ischemic postconditioning，IPO)是指心肌缺血后，在接受长时间再灌注之前给予的一组反复、短暂的再灌注/缺血循环，这种处理可以明显减轻心肌再灌注损伤。研究证明，大鼠心脏左冠状动脉前降支(LAD)结扎造成缺血30 min，给予缺血/再灌注处理(10 s/10 s)5个循环后处理，随后恢复冠脉血流，能使大鼠的心肌梗死面积较对照组明显减少。但是关于缺血后处理的研究大都集中在再灌注早期（再灌注3～6 h），在再灌注24 h缺血后处理是否具有心肌保护作用的相关研究较少。因此，本实验通过构建心肌缺血再灌注及缺血后处理大鼠模型，观察在再灌注24 h的心肌梗死面积以及诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)分子的改变，旨在探讨缺血后处理心肌保护作用的时间窗及其相应的分子机制。
　　方法：
　　选取体质量220-250 g的健康雄性Wistar大鼠126只，随机均分为7组，每组18只大鼠又根据再灌注时间不同分为两个小组（再灌注3h、24h; n=9）。①缺血再灌注组（I/R组）:左冠状动脉前降支(LAD)结扎缺血30 min，然后直接恢复再灌注;②缺血后处理组（IPO组）:30 min LAD缺血，持续性再灌注前给予5个循环的缺血/再灌注后处理(10 s/10 s);③缺血后处理+1400W(iNOS抑制剂)组（IPO+1400W组）:缺血后处理前5 min给予大鼠尾静脉注射1400W(1 mg/kg);④缺血再灌注+1400W组（I/R+1400W组）:直接恢复再灌注前5 min尾静脉给予大鼠1400W(1 mg/kg);⑤缺血后处理+LY294002（PI3K阻断剂）组（IPO+LY294002组）:缺血后处理前5 min给予大鼠尾静脉注射LY294002(0.3mg/kg);⑥缺血再灌注+LY294002组（I/R+LY294002组）:直接恢复再灌注前5min尾静脉给予大鼠LY294002(0.3 mg/kg);⑦假手术组（Sham）:LAD只穿线，不结扎，其余手术步骤与其他组别大鼠一致。在再灌注3h和24 h，每组分别随机选取3只大鼠做心肌切片进行TTC染色，用于测量梗死面积。剩余的老鼠留取血清标本及组织标本，采用Elisa方法检测血清肌酸激酶(CK)活性，免疫组织化学染色法检测心肌组织p-Akt的蛋白表达水平，Western blot法检测p-Akt及iNOS的表达。采用SPSS16.0软件对实验数据进行统计分析。
　　结果：
　　1.心肌梗死面积测定:Sham组大鼠无明显心肌梗死。在再灌注3h和24 h，与I/R组相比，IPO组均显著减少了心肌梗死面积，组间差异均有统计学意义(p＜0.05);再灌注24 h与再灌注3h相比，I/R组和IPO组的梗死面积均增大。在再灌注24 h，iNOS抑制剂(1400W)和PI3K阻断剂(LY294002)均能阻断IPO保护心肌的作用，即:I/R组、IPO+1400W组、IPO+LY294112组梗死面积无显著组间差异(p＞0.05)。
　　2.血清CK的活性:缺血前，各组大鼠血清CK活性无明显差异。在再灌注24 h，缺血后处理显著降低CK活性，差异有统计学意义（P均＜0.05）。但是，iNOS抑制剂1400W完全抑制了IPO的保护作用，即IPO+1400W组与I/R组CK活性的差异无统计学意义。
　　3.缺血心肌组织p-Akt表达:假手术组中，p-Akt蛋白的表达量很低。在再灌注3h，IPO组p-Akt的表达比I/R组p-Akt的表达高6倍(p＜0.05)，LY294002能够阻断后处理保护性激活Akt的作用;但是，在再灌注24 h， IPO组与I/R组p-Akt的表达无明显差异(p＞0.05)。
　　4.缺血心肌组织iNOS的表达:在再灌注24 h，与I/R组相比，IPO组iNOS的表达显著增高，组间差异有统计学意义(p＜0.05); PI3K阻断剂LY294002能阻断后处理升高iNOS表达的作用。在再灌注3h，iNOS的表达组间无明显差异(p＞0.05)。
　　结论：
　　心肌缺血再灌注24 h，IPO仍具有心肌保护作用，这种保护作用与iNOS表达上调有关，而iNOS的上调由PI3K/Akt信号通路所介导。

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结果

讨论

结论

创新与不足

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参考文献

综述 心肌缺血后处理的研究进展

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攻读学位期间发表的学术论文