周期性牵张力对血管平滑肌细胞增殖、迁移及胶原代谢的影响及其机制研究

摘要

本文分为两个部分进行探讨：
　　论文Ⅰ 牵张力介导ACE2的表达及其对平滑肌细胞增殖、迁移的影响
　　目的:
　　(1)探讨周期性牵张力对血管平滑肌细胞ACE2表达的影响;
　　(2)明确ACE2在病理性牵张力(18％ elongation，1Hz)调节人主动脉平滑肌细胞生物学功能中的作用;
　　(3)明确病理性牵张力(18％ elongation，1Hz)调节血管平滑肌细胞ACE2表达的分子机制。
　　方法：
　　1.人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)培养与处理
　　人主动脉平滑肌细胞株购自美国菌种保藏中心ATCC(American Type Cell Collection)，待平滑肌细胞生长至完全融合后，用吸管吸掉旧培养基，PBS冲洗细胞两遍，在细胞培养瓶中加入适量事先预热的0.25％胰蛋白酶，显微镜下观察，至平滑肌细胞变圆后，轻轻拍打至细胞脱落，加入适量完全培养基中和胰酶，吹打细胞，使平滑肌细胞全部掉落，离心5min(1000r/min)。离心结束，用吸管吸掉上清，加入新的完全培养基，转入新的细胞培养瓶中，将培养瓶放入含5％ CO2的37℃细胞培养箱中继续培养。待平滑肌细胞贴壁完全后，显微镜下观察细胞形态及密度。
　　2.动物模型的建立
　　我们应用大鼠腹主动脉缩窄模拟血管压力负荷升高，20只雄性Wistar大鼠(200-250g)随机分为两组:腹主动脉缩窄组(n-10)和对照组(n=10)，分别于术后3、5及7天后取材。
　　3.实时荧光定量PCR分析
　　刺激结束后利用Trizol法提取平滑肌细胞中的总RNA，并测定RNA浓度。根据试剂盒说明，使用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒进行逆转录反应，再使用TaKaRa公司的实时定量PCR试剂盒进行PCR反应。反应结束后得到Ct值，用相对定量的方法计算2-ΔΔCt，并分析数据。以测定平滑肌细胞内ACE2及ACE的mRNA表达情况。
　　结果：
　　1.周期性牵张力对平滑肌细胞内ACE2、ACE、Ang(1-7)、AngⅡ表达的影响
　　在时间-效应实验中，18％机械牵张力能够抑制ACE2的表达，在12小时时间点达到最大抑制效应(p＜0.01)，同时ACE2的活性下降(p＜0.05);而18％机械牵张力促进ACE的表达(p＜0.05)，其mRNA于刺激后12小时达到峰值(p＜0.01);18％机械牵张力作用3、6小时后，AngⅡ、Ang(1-7)水平比0小时对照组无明显变化，18％牵张力作用12h后，AngⅡ水平显著增加(P＜0.01)，而Ang(1-7)水平显著降低(P＜0.01)，且这一趋势持续至机械牵张力刺激24小时。
　　在张力-效应实验中，与静止对照组相比，18％机械牵张力刺激12小时后，ACE2表达下降(p＜0.05)、活性降低(p＜0.05);与生理牵张力刺激组相比，18％牵张力刺激12小时后，ACE2表达下降(p＜0.05)、活性降低(p＜0.01)。而18％牵张力作用12小时后，其ACE表达比静止对照组显著增加(p＜0.01)，比生理牵张力刺激组亦显著增加(p＜0.01)。与静止对照组相比，18％牵张力干预平滑肌细胞12小时后，AngⅡ水平升高明显(P＜0.01)，而Ang(1-7)水平降低明显(P＜0.01);与生理牵张力刺激组相比，AngⅡ水平亦升高明显(P＜0.01)，Ang(1-7)水平亦降低明显(P＜0.01)。
　　2.体内试验验证压力负荷对血管平滑肌细胞ACE2及ACE表达的影响
　　免疫组化结果显示:与假手术组相比，大鼠腹主动脉缩窄5及7天后，ACE2表达下降(P＜0.01);而大鼠腹主动脉缩窄7天后，ACE表达升高(P＜0.01)。WesternBlot结果显示:与假手术组相比，大鼠腹主动脉缩窄5及7天后，ACE2表达下降(P＜0.01）;而ACE表达升高(P＜0.01)。
　　3.ACE2对病理性牵张力调节平滑肌细胞增殖、迁移及胶原代谢的影响
　　Brdu掺入法结果提示:与Ad-GFP组相比，Ad-GFP+stretch组促进平滑肌细胞的增殖(P＜0.01);与Ad-GFP+ stretch组相比，Ad-ACE2+ stretch组抑制平滑肌细胞增殖(P＜0.05)。
　　细胞划痕试验表明:与Ad-GFP组相比，Ad-GFP+stretch组促进平滑肌细胞的迁移（P＜0.01）;与Ad-GFP+ stretch组相比，Ad-ACE2+ stretch组抑制平滑肌细胞迁移(P＜0.05)。
　　Western Blot结果提示:与Ad-GFP组相比，Ad-GFP+stretch组胶原表达升高(P＜0.05);与Ad-GFP+ stretch组相比，Ad-ACE2+ stretch组胶原表达没有明显变化(P＞0.05)。
　　以上结果表明， ACE2参与病理性牵张力(18％ elongation，1Hz)对平滑肌细胞增殖、迁移的调节，但是不参与对胶原代谢的调节。
　　结论：
　　(1)病理性牵张力抑制ACE2及Ang(1-7)的表达，促进ACE及AngⅡ的表达;
　　(2)ACE2参与病理性牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移的调节，不参与对胶原代谢的调节;
　　(3)p38、ATF3及miR-421参与病理性牵张力对ACE2的调节作用。
　　Ⅱ 牵张力介导P4Hα1/MMPs的表达及其对平滑肌细胞胶原代谢的影响
　　目的:
　　(1)探讨周期性牵张力对血管平滑肌细胞P4Hα1、MMPs、TIMP-1、TIMP-2及胶原表达的影响;
　　(2)明确病理性牵张力(18％ elongation，1HZ)调节血管平滑肌细胞P4Hα1及MMP-2表达的分子机制;
　　(3)研究ACE2对血管平滑肌细胞P4Hα1、MMP-2表达的影响。
　　方法:
　　人主动脉平滑肌细胞株购自美国菌种保藏中心(ATCC)，待平滑肌细胞生长至完全融合后，用吸管吸掉旧SMCM，PBS冲洗细胞两遍后，在细胞培养瓶中加入事先预热的0.25％胰蛋白酶，拧紧瓶盖，显微镜下观察，待平滑肌细胞变圆后，轻轻震荡至细胞脱落，加入适量培养基中和胰酶，吹打细胞，使平滑肌细胞掉落，移至离心管中，离心5min(1000r/min)。离心结束，弃掉上清，加入新的完全培养基，转入新的培养瓶放入含5％ CO2的37℃细胞培养箱中继续培养。第4-7代HASMCs用于实验。
　　结果：
　　1.病理性牵张力对人主动脉平滑肌细胞内P4Hα1、MMPs及TIMPs裹达的影响
　　在时间-效应实验中，病理性牵张力(18％ elongation，1HZ)能够促进P4Hα1的表达，在12小时时间点达峰(p＜0.05)。明胶酶谱法检测MMPs的活性，发现18％牵张力刺激可以增加HASMCs中MMP-2的活性(p＜0.05)，但在该实验中未能检测出MMP-9的活性。RT-PCR及Westem blot检测发现，病理性牵张力能够促进MMP-2的表达(p＜0.05)。而病理性牵张力刺激对TIMP-1及TIMP-2的表达没有明显影响(p＞0.05)。
　　在张力-效应实验中，与静止对照组及生理牵张力刺激组相比，病理性牵张力刺激12小时后，P4Hα1显著升高(p＜0.01)。应用明胶酶谱法检测，10％及18％牵张力均能升高平滑肌细胞内MMP-2的活性(p＜0.01)，而与10％牵张力组相比，18％牵张力升高MMP-2活性的程度更为明显(p＜0.01)。RT-PCR及Weaernblot结果提示，与静止对照组及生理牵张力刺激组相比，18％机械牵张力能够促进MMP-2的表达(p＜0.05)。同样，10％及18％牵张力刺激平滑肌细胞12小时后，平滑肌细胞内TIMP-1及TIMP-2的表达没有明显影响(p＞0.05)。
　　2.病理性牵张力对人主动脉平滑肌细胞内胶原表达的影响
　　应用ELISA及Western blot检测平滑肌细胞内胶原蛋白的表达水平。结果提示，病理性牵张力(18％ elongation，1Hz)刺激平滑肌细胞12小时后，胶原Ⅰ及胶原Ⅲ的表达水平显著升高(p＜0.05)。
　　3.MMP-2及P4Hα1参与病理性牵张力对胶原代谢的影响
　　我们应用siRNA干扰MMP-2及P4Hα1的表达，发现MMP-2 siRNA及P4Hα1siRNA能升高或降低病理性牵张力(18％ elongation，1Hz)引起的胶原蛋白的表达，证明在病理性牵张力作用下，MMP-2及P4Hα1参与对胶原的调节。
　　结论：
　　(1)病理性牵张力(18％ elongation，1Hz)上调P4Hα1、MMP-2及胶原的表达，对TIMP-1和TIMP-2的表达没有影响;
　　(2)18％牵张力通过激活Akt和p38 MAPK-JNK信号通路促进MMP-2、P4Hα1的表达。
　　(3)MMP-2及P4Hα1参与病理性牵张力对胶原代谢的影响，ACE2不参与病理性牵张力对胶原代谢的影响，且ACE2对不影响平滑肌细胞内MMP-2和P4Hα1的表达。

目录

声明

前言

论文Ⅰ 牵张力介导ACE2的表达及其对平滑肌细胞增殖、迁移的影响

摘要

符号说明Ⅰ

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

附图

参考文献

论文Ⅱ 牵张力介导P4Hα1／MMPs的表达及其对平滑肌细胞胶原代谢的影响

摘要

符号说明Ⅰ

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．结论

附图

参考文献

致谢

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