重组腺病毒介导的β-神经生长因子基因转染大鼠内皮祖细胞的研究

摘要

脊髓损伤(spinal cord injury)是脊柱损伤最严重的并发症，常发生于高空坠落伤和车祸伤，具有很高的致残率，表现为损伤节段以下出现严重的肢体功能障碍。随着建筑业和交通运输业的高速发展，脊髓损伤的发病率逐年增加，不仅给患者带来身体和心理上的严重伤害，而且对社会和家庭都造成了严重的经济负担。然而当前对脊髓损伤的治疗措施效果十分有限，脊髓损伤后神经元细胞损伤后的修复和再生是治疗脊髓损伤的难点。随着神经生物学的飞速发展，越来越多的研究重点转向干细胞移植领域来寻求治疗脊髓损伤的方法。EPCs不仅在修复受损的血管内皮上发挥重要作用，而且在血管新生方面也起重要作用。神经生长因子不仅具有营养神经元细胞的作用，而且能促进神经元轴突生长，参与脊髓损伤后神经再生修复过程。腺病毒作为目前基因治疗中应用最多的载体，被广泛应用于将外源基因导入目的细胞内。然而通过腺病毒将二者联合用于治疗脊髓损伤的报道较少。
　　本实验采用携带β-NGF基因的重组腺病毒体外转染大鼠骨髓源的EPCs，将β-NGF和EPCs的作用结合起来，实现β-神经生长因子在内皮祖细胞的持续表达，为脊髓损伤的治疗提供了新思路。
　　目的:
　　探究β-神经生长因子(β-NGF)基因的重组腺病毒转染大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)的最佳感染复数(MOI)，并从基因转录和蛋白合成两个水平上观察转染后EPCs对β-NGF基因的表达，探讨其对脊髓损伤后神经元细胞微环境的影响。
　　方法:
　　密度梯度离心法分离、全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓源EPCs，免疫荧光法检测EPCs特异性表面分子CD34、CD133和VEGFR-2的表达。用不同MOI值的携带β-NGF基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒转染EPCs，确定最佳的MOI值。用携带β-NGF基因的重组腺病毒转染的细胞为实验组（A组），用空载的重组腺病毒转染的细胞为阴性对照组（B组），未转染的细胞为空白对照组（C组）。RT-PCR法、Western blot法和ELISA法检测NGF的表达。
　　结果:
　　成功分离、培养出大鼠骨髓源EPCs，特异性表面分子CD34、CD133和VEGFR-2经鉴定呈阳性表达;携带β-NGF基因的重组腺病毒转染EPCs最佳的MOI为70;转染成功的细胞β-NGF基因在mRNA和蛋白两个不同的水平上表达都升高，并持续向细胞外分泌。
　　结论:
　　1.携带β-NGF基因的重组腺病毒可成功转染EPCs，成功转染β-NGF基因的内皮祖细胞能在不同水平上高表达β-NGF基因。
　　2.成功转染β-NGF基因的EPCs能持续向细胞外分泌有活性的β-NGF蛋白，能形成有利于神经元细胞的修复和再生的微环境。

目录

声明

摘要

符号说明(按出现的先后顺序)

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

实验结果

3．1 内皮祖细胞的形态

3．2 大鼠源内皮祖细胞特异性表面分子的免疫荧光检测

3．3 携带β-NGF基因的重组腺病毒转染大鼠源内皮祖细胞

3．4 在转录水平利用Real Time-PCR检测β-NGF在细胞内的表达

3．5 在蛋白水平利用Western Blot法检测内皮祖细胞内β-NGF的表达

3．6 ELISA法检测内皮祖细胞外β-NGF蛋白的分泌量

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文