Epac1表达下调抑制卵巢癌细胞增殖的作用机制研究

摘要

目的:
　　本课题探讨的是Epac1下调在卵巢癌中的作用及其机制。首先我们检测了卵巢癌细胞中的Epac1表达，然后在卵巢癌细胞中进行Epac1干扰，检测Epac1下调之后卵巢癌细胞的增殖变化情况，接着进行了通路的研究，从两条信号通路入手:1、MAPK信号通路2、AKT/CyclinD1/CDK4信号通路。最后，用体内裸鼠成瘤实验验证体外实验的现象和机制。
　　方法:
　　一、检测卵巢癌细胞系SKOV3，OVCAR3和CAOV3中Epac1的表达情况
　　用real time RT-PCR及western blot的方法检测卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3及CAOV3中Epac1 mRNA和蛋白的表达情况。
　　二、Epac1表达下调对卵巢癌细胞增殖能力和克隆形成能力的影响
　　1、选取相对高表达Epac1的卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3，用Epac1siRNA分别转染SKOV3和OVCAR3，siControl作阴性对照。RT-PCR鉴定Epac1的干扰效率。
　　2、利用CCK8方法检测Epac1表达下调后对SKOV3和OVCAR3细胞增殖的影响。分别在0h、24h、48h、72h四个时间点加入CCK8试剂，37℃孵育1h后，450nm波长处测OD值。
　　3、利用克隆形成实验检测Epac1下调后对SKOV3和OVCAR3细胞克隆形成能力的影响。6孔板中，SKOV3每孔500个细胞，OVCAR3每孔1000个细胞。共培养约2-3周，期间，每隔4-5天换液一次。培养结束，染色:甲醇固定10min，1％结晶紫染20分钟。
　　三、Epac1表达下调对卵巢癌细胞周期和凋亡的影响
　　1、卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3，用Epac1 siRNA分别转染，siControl作阴性对照。
　　2、利用流式细胞术检测Epac1表达下调后，SKOV3和OVCAR3细胞的细胞周期的变化。转染48h后，收集悬浮细胞及贴壁细胞，计数，使细胞浓度达1×106个/ml。加600μl冷PBS和1400μl无水乙醇（即70％乙醇），-20℃固定过夜。加入含50μg/mL PI，100μg/mL RNaseA的PBS500μL，4℃避光孵育30 min，上机检测。
　　3、利用流式细胞术检测Epac1表达下调后，SKOV3和OVCAR3细胞的细胞凋亡的变化。转染48h后，收集悬浮细胞及贴壁细胞，1×结合缓冲液重悬，计数，使细胞浓度达1×106个/ml。FITC AnnexinⅤ和PI双染，室温避光孵育15min。上机检测。需在1小时内检测完毕。
　　四、Epac1下调表达对卵巢癌细胞增殖信号通路的影响
　　1、利用western blot的方法检测Epac1表达下调后，SKOV3和OVCAR3细胞中MAPK信号通路的变化。首先在SKOV3和OVCAR3细胞中干扰Epac1表达，然后通过westem blot的方法检测siEpac1组、 siControl组及空白对照组中MAPK通路分子p-ERK，ERK，p-JNK，JNK，p-P38和P38的变化情况。
　　2、利用western blot的方法检测Epac1表达下调后，SKOV3和OVCAR3细胞中AKT信号通路的变化。首先在SKOV3和OVCAR3细胞中干扰Epac1表达，然后通过western blot的方法检测siEpac1组、 siControl组及空白对照组中p-AKT、AKT、CyclinD1和CDK4的变化情况。
　　五、体内裸鼠成瘤实验检测Epac1表达下调对卵巢癌细胞增殖以及相关信号通路的影响
　　1、选用公认的成瘤能力强的卵巢癌细胞系SKOV3进行裸鼠成瘤。体内试验共分三组:NS组、shControl组、shEpac1组。每组雌性裸鼠9只，共27只，需大量培养SKOV3细胞。细胞消化下来，活细胞计数。每只裸鼠注射SKOV3细胞7×106个，体积100μl，用生理盐水稀释，调节细胞终浓度7×107个/ml。用1ml注射器裸鼠腋下注射，然后随机分为3组。
　　2、每天观察肿瘤生长情况，两周后，瘤体大小适当，进行治疗。NS组给予瘤体100μl生理盐水，shControl组给予30μg shControl质粒，shEpac1组给予30μgshEpac1质粒。隔天治疗一次，期间，每天测量瘤体长径和短径。绘制肿瘤生长曲线，计算肿瘤体积，公式:肿瘤体积=长径(cm)×短径(cm)×短径(cm)×0.5。
　　3、治疗约9天后，处死裸鼠，取出肿瘤，测其长径和短径，称量瘤重。然后将肿瘤组织进行石蜡包埋用免疫组化方法检测Epac1表达，提取蛋白用westernblot方法检测Epac1及通路分子变化。
　　结果:
　　一、Epac1 mRNA及蛋白在卵巢癌细胞系SKOV3，OVCAR3中高表达
　　为了确定Epac1在卵巢癌细胞中的表达情况，我们选取三种卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3和CAOV3。real time RT-PCR和westemblot的方法测定Epac1mRNA及蛋白的表达，结果显示Epac1在SKOV3和OVCAR3中高表达，在CAOV3中低表达。于是，我们选择了高表达Epac1mRNA和蛋白的SKOV3和OVCAR3细胞系进行后续实验。
　　二、特异的靶向干扰Epac1的siRNA可以有效下调SKOV3，OVCAR3中Epac1的表达
　　为了阐述Epac1下调对卵巢癌细胞的影响，我们设计了两条靶向Epac1的特异性小干扰RNA，将它们转染入SKOV3和OVCAR3细胞。用RT-PCR的方法测定干扰效率。结果显示，转染后的SKOV3和OVCAR3细胞Epac1表达量明显减少。
　　三、Epac1下调抑制卵巢癌细胞的细胞增殖和克隆形成能力
　　1、用CCK8细胞活力实验测定Epac1下调对SKOV3和OVCAR3细胞增殖的影响，实验结果显示，Epac1下调之后，SKOV3和OVCAR3的细胞活力均明显下降，说明Epac1下调明显抑制了细胞增殖。
　　2、用克隆形成实验测定Epac1下调对SKOV3和OVCAR3克隆形成能力的影响，实验结果显示，Epac1下调之后，SKOV3和OVCAR3的克隆形成能力均明显下降，说明Epac1下调明显抑制了卵巢癌的细胞克隆形成能力。
　　四、Epac1下调引起卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3的G1期阻滞，但是，凋亡并没有发生明显变化
　　1、流式细胞术的方法检测Epac1下调对卵巢癌细胞周期的影响，发现转染siEpac1的细胞与siControl相比，G1期细胞数明显增多，说明Epac1下调将SKOV3和OVCAR3的细胞周期阻滞在G1期。
　　2、流式细胞术检测细胞凋亡。结果显示，Epac1下调后细胞凋亡情况与对照组无明显差异。此结果说明，Epac1下调并不能影响SKOV3和OVCAR3细胞的凋亡。
　　五、Epac1下调抑制SKOV3和OVCAR3细胞中p-AKT, CyclinD1和CDK4的表达，但是对MAPK信号通路分子没有明显影响
　　1、在SKOV3和OVCAR3细胞中干扰Epac1表达后，通过western blot的方法检测了MAPK通路分子p-ERK，ERK，p-JNK，JNK，p-P38和P38，结果显示，与对照组相比，p-ERK，p-JNK和p-P38并无明显变化。说明在卵巢癌中，Epac1下调导致的增殖的抑制，并不是通过MAPK信号通路发生的。
　　2、在SKOV3和OVCAR3细胞中干扰Epac1表达后，通过western blot的方法检测了p-AKT、CyclinD1和CDK4的变化，结果显示，与对照组相比，实验组p-AKT、CyclinD1和CDK4表达量明显下降。
　　六、在体内荷瘤裸鼠中，Epac1下调明显抑制卵巢癌细胞增殖，也通过抑制p-AKT,CyclinD1和CDK4的表达发挥作用
　　1、在体外，利用RT-PCR和westem blot的方法测定新制备的Epac1 shRNA的干扰效果，结果显示，shEpac1可以有效下调SKOV3细胞中的Epac1表达。
　　2、SKOV3进行裸鼠成瘤，约两周后，瘤体长成，进行治疗约九天后，处死裸鼠。生长曲线及肿瘤实体显示，shEpac1质粒治疗的裸鼠瘤体大小明显小于对照组。剥离后的肿瘤体积，重量也是明显小于对照组。
　　3、瘤体病理切片经免疫组化染色显示，Epac1阳性着色位于细胞质而非细胞核，且shEpac1质粒治疗组的Epac1表达明显低于对照组。
　　4、肿瘤组织提取蛋白，用western blot方法检测p-AKT、CyclinD1和CDK4分子表达，发现shEpac1质粒治疗组的p-AKT、CyclinD1和CDK4蛋白表达明显低于对照组。
　　结论:
　　1、Epac1 mRNA及蛋白在卵巢癌细胞系SKOV3和OVCAR3中是高表达的，在CAOV3中是低表达的。
　　2、Epac1下调在体外可以抑制卵巢癌细胞的增殖能力、克隆形成能力和细胞周期进程（G1期阻滞），但对细胞凋亡无明显影响。Epac1下调在体内同样可以抑制卵巢癌细胞的增殖。
　　3、Epac1下调对卵巢癌细胞增殖的影响是通过抑制AKT/CyclinD1/CDK4蛋白通路，而非MAPK信号通路。

目录

声明

摘要

重要符号说明

前言

材料

方法

一、免疫组化染色

二、卵巢癌细胞培养

三、shRNA质粒提取

四、PCR

五、Western Blot

六、体外细胞增殖检测

七、细胞周期测定

八、凋亡测定

九、体内裸鼠成瘤模型

十、统计分析

结果

一、Epac1 mRNA及蛋白在卵巢癌细胞系SKOV3、OVCAR3中高表达，在CAOV3中低表达

二、特异的靶向干扰Epac1的siRNA(siEpac1)可以有效下调SKOV3、OVCAR3中Epac1的表达

三、Epac1下调抑制卵巢癌细胞的细胞增殖和克隆形成能力

四、Epac1下调引起卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3的G1期阻滞，但是，凋亡并没有发生变化

五、Epac1下调抑制SKOV3和OVCAR3细胞中p-AKT，CyclinD1和CDK4的表达，但是对MAPK信号通路没有明显影响

六、在体内荷瘤裸鼠中，Epac1下调明显抑制浆液性卵巢癌细胞增殖

七、在体内，Epac1下调同样抑制卵巢癌p-AKT，CyclinD1和CDK4的表达

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文