阻断Kv1.3对动脉粥样硬化中炎症因子诱导的巨噬细胞极化的影响

摘要

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)越来越严重的威胁全世界人类的生命，而且对于其防治目前仍是世界性公共卫生的难题。目前普遍观念是认为As是一种慢性炎症性疾病，在As斑块的形成、发展以及破裂中，巨噬细胞起到了极其重要的作用。研究表明，进入组织中的巨噬细胞分化为不同的亚型发挥作用，其中最主要的是两种，一是经典活化型，即M1型，其特点是具有促炎表型，能辅助Th1细胞参与炎症反应和杀灭肿瘤;二是替代活化型，即M2型，主要调控组织修复和重塑，促进Th2参与免疫反应。巨噬细胞M1/M2表型的分化，能够调节淋巴细胞亚群Th1/Th2的极化，研究表明，As存在着Th1/Th2、M1/M2失衡，由此可见调控巨噬细胞表型分化，将有助于抑制M1型巨噬细胞和Th1淋巴细胞介导的促炎反应，增强M2型巨噬细胞和Th2淋巴细胞介导的抗炎作用。
　　巨噬细胞膜上的电压依赖性钾通道是参与细胞功能调控的重要通道之一，其中Kv1.3钾通道是单核巨噬细胞Kv1家族通道表达的主要亚型。自行设计合成的针对人Kv1.3钾通道E314肽段的抗体（hKv1.3E314抗体）能特异性抑制巨噬细胞膜上的Kv1.3通道。研究发现，阻断巨噬细胞表面的钾离子通道可减少巨噬细胞对促炎因子的分泌，巨噬细胞过表达Kv1.3可显著增加M1型巨噬细胞产物TNF-α水平，而对巨噬细胞Kv1.3基因进行沉默表达后，TNF-α水平明显减少。由此可见，Kv1.3通道对于巨噬细胞的功能改变具有重要的调控作用。
　　目的：探讨阻断Kv1.3通道对动脉粥样硬化发生发展过程中炎症因子诱导的巨噬细胞极化方向的影响，探讨Kv1.3通道阻断剂的作用，从而为As的防治提供新的思路。
　　方法：购买自中国科学院细胞库的THP-1单核细胞给予佛波酯(PMA)100ng/ml诱导72h使其分化为巨噬细胞。
　　将贴壁的巨噬细胞重新接种在6孔板中，分为4组，分别编号1、2、3、4:1号组加入LPS和IFN-γ孵育细胞;2组给予抗hKv1.3E314抗体孵育细胞;3组细胞依次给予抗hKv1.3E314抗体及LPS和IFN-γ孵育细胞;4组用PBS处理作为空白对照。倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化;流式细胞术和qRT-PCR鉴定巨噬细胞表型标志性分子iNOS、Arg-1及CD206; ELLISA检测细胞上清液中IL-10、IL-23、TNF-α的表达水平。
　　结果：四组细胞流式结果及qRT-PCR结果提示LPS+IFN-γ协同作用，能促进巨噬细胞iNOS表达增高，CD206及Arg-1表达降低(P＜0.05)，而hKv1.3E314抗体+LPS+IFN-γ联合诱导巨噬细胞，促进CD206及Arg-1的高表达，iNOS表达降低(P＜0.05);ELLISA结果显示LPS+IFN-γ能促进巨噬细胞分泌IL-23、TNF-α明显升高(P＜0.05)，hKv1.3E314抗体+LPS+IFN-γ协同能促进IL-10表达水平明显提高(P＜0.05)。单纯使用抗hKv1.3E314抗体干预巨噬细胞其流式结果、qRT-PCR及ELLISA结果提示与对照组（PBS干预组）无明显差异(P＞0.05)。
　　结论：Kv1.3参与了巨噬细胞表型分化的调控，通过阻断巨噬细胞上的Kv1.3通道，可以促进巨噬细胞向着具有抗炎作用的M2型巨噬细胞分化。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

研究对象与方法

1．研究对象

2．主要试剂和仪器

3．实验方法

4．统计分析

结果

1．单核细胞及巨噬细胞形态学变化

2．流式细胞术鉴定巨噬细胞表型表达

3．RT-PCR检测iNOS及Arg-1基因的相对表达量

4 ELLISA检测IL-10、IL-23及INF-α的表达

讨论

1．巨噬细胞、淋巴细胞参与易损斑块形成

2．钾通道Kv1．3参与淋巴细胞调控的研究

3．钾通道Kv1．3参与巨噬细胞调控的研究

4．抗hKv1．3E314抗体对巨噬细胞极化的调控

结论

1．主要结论

2．局限性

附录

参考文献

文献综述

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文