动脉粥样硬化血清生物标记物的蛋白组学分析及CDK9疾病相关性研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 利用蛋白组学方法研究冠状动脉粥样硬化血清蛋白标记物
　　目的：
　　优化血清蛋白组学技术方法，探讨动脉粥样硬化发病过程中血清蛋白的异常表达情况。
　　方法：
　　1、研究对象
　　随机选取2012年10月至2014年10月山东省立医院及山东大学齐鲁医院确诊冠心病患者43例，其中男25例，女18例，年龄60±3.3岁。入选病例均符合WHO制定的冠心病诊断标准。选择同期健康查体者38例作为健康对照，其中男17例，女21例，年龄58±11.1岁。无动脉粥样硬化、冠脉血管疾病或炎症性疾病;经常规检测胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和血糖水平，排除高脂血症、高血压、糖尿病。经病史询问、体检、心电图检查和其它生化检查无异常发现。本研究由山东大学医学院伦理委员会批准，患者均知情同意。
　　2、血清收集和血清蛋白的提取处理
　　抽取冠状动脉粥样硬化患者或健康对照空腹静脉血5毫升，分离血清。经Albumin and IgG Removal Kit操作处理，去除白蛋白和IgG等血清高丰度蛋白。经ReadyPrepTM2-D Clean-up Kit（二维清除试剂盒）操作处理，清除血清样本中的盐类、脂类、核酸等干扰物质。随后收集上清液，将约300μg的蛋白质重悬在尿素水化液中。
　　3、蛋白等电聚焦(IEF)
　　将IPG干胶条(pH3-10，NL:18cm，ImmobilineTM DryStrip)条槽置于水平板上，加入样本尿素水化液，然后滴加Dry Strip覆盖液覆盖，加盖封闭。沿电极平行方向将凝胶条槽置于IPGphor电极板上，按照要求设置血清样本电压程序。
　　结果：
　　1、成功优化了血清蛋白组学研究策略:
　　1.1 去除血清样本中的高丰度蛋白和去盐去杂质
　　鉴于血清白蛋白和免疫球蛋白约占血清总蛋白的90％，而疾病血清蛋白标记物通常为低丰度蛋白，高丰度蛋白可严重干扰低丰度蛋白的探测，因此本论文利用Albumin and IgG Removal Kit(Pierce，Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)，成功去除了血清样本中白蛋白和免疫球蛋白IgG两种高丰度蛋白，从而为探测疾病相关低丰度蛋白建立了基础。
　　1.2 多步骤优化血清蛋白组学操作方法
　　在研究过程中，针对血清样本在去除高丰度蛋白后，二维电泳凝胶图仍存在蛋白点数少，出现横纹、垂直条纹等问题，本文在上样的蛋白量、SDS-PAGE的pH值、SDS浓度条件、IEF电泳条件及程序等方面进行了一系列探索，经2D-clean-up kit去除盐类、脂质、核酸等干扰物质，改进IEF电压程序和SDS-PAGE条件，最终获得比较理想的二维电泳图，蛋白点分离较好。
　　2.证实在动脉粥样硬化发病过程中存在异常血清蛋白表达
　　通过2D PDQuest的蛋白质点分析检测到每患者样品中有509±31蛋白质点，每健康对照样品中有565±29蛋白质点。
　　通过对比分析研究冠状动脉粥样硬化患者及健康对照者的血清标本凝胶结果，发现冠状动脉粥样硬化患者和健康对照间存在33种差异表达蛋白质。
　　3.所识别差异蛋白质的功能分类
　　根据已经确定或推测的功能和细胞信号通路，将全部27种确定的蛋白质进一步划分为6个不同功能组别，包括细胞增殖和凋亡相关蛋白、炎症因子相关蛋白、免疫因子相关蛋白、能量代谢相关蛋白、信号通路相关分子和其它分子如血管紧张素Ⅱ受体等。
　　第二部分 CDK9在冠状动脉粥样硬化疾病中的表达状况研究
　　目的：
　　进一步探讨CDK9在冠状动脉粥样硬化患者血清、单核细胞和冠状动脉粥样硬化斑块组织中的表达水平，为CDK9作为动脉粥样硬化血清标记物并以CDK9靶向诊断和治疗冠状动脉粥样硬化疾病提供依据。
　　方法：
　　1.研究对象同第一部分。
　　2.Western blot和ELISA检测血清CDK9表达水平
　　分离冠状动脉粥样硬化患者和健康对照的空腹静脉血血清。样本稀释后做Western Blot检测血清CDK9蛋白表达水平;利用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测血清CDK9水平。
　　3.外周血单个核细胞(PBMCs)中CDK9表达的检测
　　1)分离PBMCs、淋巴细胞和单核细胞
　　收集冠状动脉粥样硬化患者和健康对照的空腹静脉抗凝血，通过Ficoll-Hypaque梯度离心方法分离得到外周血单个核细胞(PBMCs)，在PBMCs中加Hanks平衡盐液重新混悬细胞，进一步分离单核细胞和淋巴细胞。
　　2)RT-PCR检测外周血单个核细胞中CDK9的mRNA表达
　　分别提取PBMCs、淋巴细胞和单核细胞总RNA，利用人CDK9的特异引物进行RT-PCR，检测所测细胞内CDK9 mRNA表达状况。
　　结果：
　　1.患者血清CDK9高表达
　　Western Blot结果表明，在冠状动脉粥样硬化患者血清中CDK9表达明显升高，与健康对照者相比，p＜0.01; ELISA结果显示，患者血清中CDK9为149.70±105.22 U/L，而健康对照为64.51±25.94 U/L，二者相比有显著差异，p＜0.01。
　　2.患者外周血单个核细胞及单核细胞中CDK9高表达
　　与健康对照组相比，动脉粥样硬化患者组外周血单个核细胞，单核细胞和淋巴细胞中CDK9 mRNA及蛋白表达均明显升高。二者有显著差异，尤其是单核细胞中的表达显著高于健康对照组。两组中CDK9在外周血单核细胞亚群中的表达均高于其在淋巴细胞亚群的表达，p＜0.05。
　　第三部分 CDK9对动脉粥样硬化炎症中单核细胞影响的初步研究
　　目的：
　　研究炎症因子刺激下，抑制CDK9后对单核细胞CDK9表达、增殖、细胞周期、细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响。
　　方法：
　　1.THP-1细胞培养及处理
　　人单核细胞急性白血病细胞系(THP-1)购于美国ATCC(American TypeCulture Collection，Manassas，VA，USA)，山东大学药学院张彩教授惠赠，本实验室常规传代培养，液氮中保存。将活化的人THP-1细胞置于含有10％胎牛血清(FBS)，100μg/mL的链霉素，100u/mL的青霉素的完全RPMI1640培养液中，37℃5％ CO2条件下培养。分别加入TNFα50ng/mL，FLA50nM或100nM，TNFα50ng/mL+FLA100nM及RPMI培养液对照，5％ CO2，37℃培养6h或/和24h后进行不同实验。
　　2.RT-PCR:同第二部分
　　3.Western blot:同第二部分
　　结果：
　　1.FLA可明显抑制TNFα-介导的THP-1表达同种型CDK943
　　为探讨THP-1细胞CDK9两种同种型CDK955和CDK943表达影响是否存在差异，本文在培养的THP-1细胞中加入TNFα和/或FLA100 nM处理6h，然后进行两种同种型的Western Blot分析，结果显示，在TNFα刺激下，FLA抑制CDK943的作用更加明显，而CDK955同种型表达量极少，且在TNFα和/或FLA作用下变化趋势不明显，提示TNFα刺激下的单核细胞的CDK943同种型表达发生变化，而CDK955同种型无明显变化。
　　2.抑制CDK9可明显抑制TNFα介导的THP-1单核细胞增殖
　　利用CDK9抑制剂FLA100nM处理人单核细胞急性白血病细胞系THP-1细胞6h和24h，然后用CCK-8试剂盒检测细胞增殖状况，结果显示，FLA单独处理或在TNFα存在下6h和24h，THP-1细胞的增殖均可受到明显抑制，高浓度FLA作用更加明显。
　　全文结论:
　　1.成功识别冠状动脉粥样硬化患者血清存在的异常蛋白表达谱;与健康对照者血清相比，有27种差异表达蛋白。按照功能可将其分为6类，主要与炎症、免疫细胞和细胞信号通路等有关。
　　2.在识别的血清差异表达蛋白中，深入研究证实了CDK9在冠状动脉粥样硬化患者血清、外周血单个核细胞、单核细胞和动脉粥样硬化斑块组织中表达明显增高。冠状动脉粥样硬化斑块组织内CDK9高表达与高浸润性CD14+单核细胞/巨噬细胞明显正相关。
　　3.初步证实CDK9抑制可以明显抑制TNFα刺激下的人单核细胞急性白血病系THP-1细胞的CDK943同种型的表达，抑制细胞增殖，导致TNFα刺激下的单核细胞的细胞周期G2/M期阻滞，促进细胞凋亡及促凋亡蛋白表达。
　　论文创新点：
　　1.通过蛋白组学分析发现了冠状动脉粥样硬化患者和健康对照者血清蛋白的差异表达谱，获得27种差异蛋白并将其功能归类。
　　2.研究证实CDK9在冠状动脉粥样硬化患者血清、外周血单个核细胞，尤其是单核细胞中高表达。另外，还发现在动脉粥样硬化斑块组织中CDK9亦高表达，且与局部CD14高表达明显相关。结果表明:CDK9可能是冠状动脉粥样硬化重要的生物标记物。
　　3.研究发现:通过抑制CDK9表达，可以抑制TNFα刺激下的人单核细胞系THP-1细胞CDK943同种型的表达，抑制细胞增殖，导致G2/M期阻滞，促进细胞凋亡及促凋亡蛋白的表达。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 利用蛋白组学方法研究冠状动脉粥样硬化血清蛋白标记物

前言

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

1．成功优化了血清蛋白组学研究策略

2．证实在动脉粥样硬化发病过程中存在异常血清蛋白表达

3．所识别差异蛋白的功能分类

讨论

第二部分 CDK9在冠状动脉粥样硬化疾病中的表达状况研究

前言

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

1．CDK9在冠状动脉粥样硬化患者血清中表达升高

2．CDK9在冠状动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞及单核细胞中表达升高

3．CDK9在兔动脉粥样硬化斑块组织中高表达

4．CDK9在人动脉粥样硬化斑块组织中高表达

讨论

第三部分 CDK9对动脉粥样硬化炎症中单核细胞影响的初步研究

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

1．FLA明显抑制TNFα介导的THP-1单核细胞表达CDK943同种型

2．抑制CDK9可明显抑制TNFα介导的THP-1单核细胞增殖

3 抑制CDK9可明显导致TNFα介导的THP-1单核细胞G2／M期阻滞

4 抑制CDK9可明显促进TNFα介导的THP-1单核细胞凋亡

5．抑制CDK9明显促进TNFα介导的THP-1单核细胞促凋亡蛋白表达

讨论

全文小结

论文创新点

附图表

参考文献

致谢

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