酞菁类靶向及近红外光敏剂的设计合成及生物活性测试

摘要

光敏剂是光动力治疗的三要素之一。在光动力过程中，光敏剂吸收光线中的能量，并将其传递给临近的氧，形成能够氧化生物大分子的活性氧。光敏剂是光动力过程中能量传递的枢纽。因此，光敏剂的性质决定了光动力治疗的效果。自从1955年Schwartz等人合成了血卟啉衍生物后，人们对光敏剂的研究一直延续至今并大致可以分为三代。血卟啉衍生物是最早应用于临床的光敏剂，但其较短的吸收波长、复杂的成分和较慢的代谢速度限制了光动力治疗的应用。第二代光敏剂改善了血卟啉衍生物在这些方面的不足，第三代光敏剂则在第二代光敏剂的基础上进一步提高了对肿瘤细胞的选择性。理想光敏剂应该具有一定的水溶性，并有较高的光毒性和低避光毒性，在红光和近红外区有较强吸收，化学性质稳定，体内代谢快，同时对肿瘤具有选择性。其中，如何提高光敏剂对肿瘤细胞的靶向作用和增大光敏剂的吸收波长是现在光敏剂研究中的热点。
　　酞菁是卟啉的人工合成衍生物，具有吸收光波长较长，性质稳定、可修饰位点多、单线态氧产率高和代谢速度快等特点。这些特点使其成为最有潜力的第二代光敏剂之一。但同时，酞菁也存在易聚集、溶解性较差的缺点。因此，如何对酞菁进行修饰一直以来是人们关注的热点。
　　多肽是少量氨基酸经过脱水缩合后形成具有有序结构的环状或链状化合物。它的结构简单，在生物体内天然存在，其生物活性与氨基酸的序列相关。当细胞发生癌变后，表面部分整合素发生过表达，具有适当序列的多肽能够与癌细胞表面过表达的整合素特异性结合。αvβ3整合素在多种癌细胞和肿瘤血管表面过表达，而在其他细胞表达较少;同时具有RGD（arginine-glycine-aspartic）序列的多肽对αvβ3整联蛋白具有极高的选择性。因此带有RGD序列的多肽是一种重要的增强光敏剂对肿瘤选择性的靶向因子。
　　基于上述背景，在本论文设计合成并表征了带有不同取代基的RGD引导酞菁锌配合物，并对其进行了光物理化学和生物性质的测试。此外本论文还对一种近红外萘菁基光敏剂进行了生物性质的测试。论文的主要内容如下:
　　1.设计合成了单羧基取代的不对称酞菁锌配合物，并将其与c(RGDyK)通过酰胺键相连接。高分辨质谱和HPLC分析结果证明化合物已经成功合成并具有较高的纯度。随后测试了连接RGD的酞菁锌的光物理化学性质和生物活性，并与不带RGD的酞菁锌进行比较。测试结果显示，RGD的引入对酞菁锌本身的性质影响较小，其紫外可见光谱和荧光光谱仪均未发生明显变化，而单线态氧产率和荧光量子产率也很相近。除DMF外，两种酞菁锌在聚氧乙烯蓖麻油的存在下在培养基中也表现出了良好的溶解性。采用萃取法对αvβ3高表达细胞DU145中的样品吸收量进行了测试，并比较了两种样品在DU145内的荧光。结果显示，RGD的引入增强了酞菁锌在αvβ3整合素高表达细胞系DU145内的吸收。在光照条件下，RGD引导酞菁锌表现出了更强的光毒性，其IC50值低至0.04μM。这些都表明这种RGD引导酞菁锌配合物可以用作靶向光动力治疗光敏剂。
　　2.向酞菁环外侧引入对叔丁基苯氧基，设计合成了由三个叔丁基和一个羧基取代的不对称酞菁锌配合物，并通过酰胺键将其与多肽c(RGDyK)相连接。所得产物经高分辨质谱和HPLC分析，证实其具有较高的纯度。光谱分析结果表明这种新型酞菁锌在有机溶剂中具有良好的溶解性，同时在0.1％聚氧乙烯蓖麻油存在时在培养基中也有一定的溶解性。与RGD结合前后的产物的荧光量子产率较低，单线态氧产率较高。细胞实验中，首先使用萃取法和细胞成像法研究了αvβ3高表达细胞对结合RGD前后的两种酞菁锌的吸收。结果显示，RGD的引入增强了αvβ3高表达细胞对光敏剂的吸收。在对细胞荧光图像的进一步研究中发现，该酞菁锌产生的荧光与线粒体探针MitotrackerRed产生的荧光吻合，具有线粒体定位的特点。随后的细胞毒性实验中，在测试所用光照条件下两种酞菁锌对DU145、PC-3和Hela细胞的毒性较弱。这些特点说明这种RGD引导叔丁基苯修饰酞菁锌配合物可以作为肿瘤-线粒体双功能探针。
　　3.萘菁类化合物具有比酞菁类化合物更大的平面共轭结构，因此其吸收波长红移至近红外区。本论文中对一种水溶性四羧基取代萘菁锌配合物的生物活性进行了研究，并与具有类似结构的四羧基取代酞菁锌进行了比较。测试结果显示，合成的萘菁锌配合物在DMF中表现出了良好的溶解性，并且在λ＞610nm和λ=750 nm两种波长的光照条件下均能够有效的产生单线态氧。该萘菁锌在培养基中呈现出一定聚集的趋势。细胞实验中，萘菁锌配合物在HeLa细胞中的细胞吸收量约为同条件下酞菁锌的一半，并表现出了相对于酞菁锌较弱的细胞内荧光。在相同光照条件下，萘菁锌配合物表现出了与酞菁锌相类似的光毒性。这些结果说明这种水溶性萘菁锌配合物是潜在的近红外光动力治疗光敏剂。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 引言

2 光动力治疗

2．1 光动力治疗筒介

2．2 光动力治疗原理

2．3 光对光动力治疗效果的影响

2．4 光敏剂对光动力治疗的影响

3 光动力治疗光敏剂的研究历史及现状

3．1 第一代光敏剂

3．2 第二代光敏剂

3．3 第三代光敏剂

4 酞菁

4．1 酞菁的基本结构及性质

4．2 酞菁的应用

4．3 酞菁在光动力治疗中的应用

5 论文的主要内容及创新点

5．1 选题依据和研究意义

5．2 本论文的主要工作

参考文献

第二章 RGD引导靶向光动力治疗光敏剂的合成及性质测试

1 引言

2 实验部分

2．1 实验试剂

2．2 实验仪器

2．3 化合物合成步骤

2．4 高效液相色谱分离条件

2．5 细胞实验

3 结果与讨论

3．1 合成

3．2 HPLC分离与鉴定

3．3 化合物的表征

3．4 紫外可见光谱

3．5 荧光光谱

3．6 不同浓度下酞菁的紫外可见吸收光谱

3．7 单线态氧测试

3．8 培养基中酞菁的光物理化学性质

3．9 细胞吸收实验

3．10 细胞内荧光成像

3．11 细胞毒性实验

4 小结

参考文献

第三章 RGD引导叔丁基苯修饰酞菁类光敏剂的合成及性质测试

1 引言

2 实验部分

2．1 实验试剂

2．2 实验仪器

2．3 化合物合成步骤

2．4 高效液相色谱分离条件

2．5 细胞实验

3 结果与讨论

3．1 合成

3．2 HPLC分离与鉴定

3．3 化合物的表征

3．4 紫外可见光谱

3．5 荧光光谱

3．6 不同浓度下酞菁的紫外可见吸收光谱

3．7 单线态氧测试

3．8 培养基中酞菁的光物理化学性质

3．9 细胞吸收实验

3．10 细胞内荧光成像

3．11 细胞内线粒体定位

3．12 细胞毒性

4 小结

参考文献

第四章 水溶性萘菁基近红外光敏剂的生物活性测试

1 引言

2 实验部分

2．1 实验试剂

2．2 实验仪器

2．3 化合物合成步骤

2．4 实验步骤

3 结果与讨论

3．1 光物理、化学性质

3．2 单线态氧产率

3．3 光敏剂在培养基中的紫外可见光谱

3．4 细胞吸收实验

3．5 细胞内荧光成像

3．6 细胞毒性试验

4 小结

参考文献

第五章 总结与展望

致谢

攻读博士学位期间发表的论文及获得的奖励