肝素四糖与β-淀粉样蛋白相互作用的研究

摘要

随着社会老年化发展，阿尔兹海默症(Alzheimer's disease，AD)作为一种中枢神经系统退行性疾病的危害越来越大。老年斑是AD的重要病理特征之一，其主要原因是淀粉样蛋白前体(amyloid protein precursor，APP)的代谢产物β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）的聚集。Aβ是在正常的生理过程中产生的代谢产物，但是其病理性的纤维聚集和寡聚体却导致AD的发生。Aβ的过量生成及其聚集成纤丝并进一步与蛋白聚糖作用导致了神经细胞毒性。因此，以Aβ为靶点寻找抑制或阻断Aβ的生成及其聚集是治疗AD的关键切入点，有效的抑制Aβ成纤丝过程是更好的介入治疗手段。
　　糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAGs)参与Aβ的生成与聚集，通过与APP的肝素结合位点作用来影响分泌酶的代谢途径，并最终促进Aβ的生成。但是，GAG的糖链组成、长度、硫酸化程度及位点都会影响其与Aβ的结合，进而引起Aβ空间构象的变化。肝素寡糖能够通过血脑屏障，可以直接作用于Aβ本身且不具有毒性，而且已经有低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）衍生物作为Aβ聚集的抑制剂应用于临床治疗，如肝素寡糖(C3)混合物。但是这类药物都是较窄分子量区间的混合物，在分子水平上因肝素寡糖细微结构差异导致其Aβ作用的构效关系并不清楚，仍然需要进一步深入的研究。
　　肝素寡糖可以对Aβ损伤的神经瘤细胞有预保护作用，在此基础上本课题旨在研究肝素四糖与Aβ40的相互作用。我们制备了三种明确结构的肝素四糖dp4-1、dp4-3、dp4-4,利用核磁共振波谱(Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)和质谱（Mass spectrum，MS）的方法对其结构进行了表征，分别是△UA2S-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS,△UA2S-GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S,△UA2S-GlcNS6S-IdoA2S-GlcNS6S。应用凝胶迁移电泳方法(Gel mobility shiftassay，GMSA)初步筛选出了与Aβ40结合相对较强的肝素四糖dp4-4,其次是dp4-3,最后是dp4-1,其中Glc6S是必要的参与相互作用的基团，而中间的糖醛酸的2S不是必要的参与作用基团。首次将氢氘交换质谱(HDX-MS)的方法应用于蛋白质和GAG的研究中，氢氘交换实验确定了Aβ与dp4-4的结合比，二者相互作用的结合位点区域肽段Y10-F19,并利用分子对接计算进一步验证了该结果。分子对接计算和GMSA结果同时证明了还原端的GlcNS6S中6S对二者结合有显著贡献，IdoA2S的2位硫酸基团不参与肝素四糖与Aβ的结合，然而该糖的羧酸基团却参与了二者结合。

目录

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摘要

缩略符号说明

第一章 前言

1．1 β-淀粉样蛋白

1．1．1 Aβ寡聚体的结构与毒性

1．1．2 Aβ原处纤维和原纤维的形成及结构

1．1．3 治疗AD的药物

1．2 糖胺聚糖

1．3 糖胺聚糖与β-淀粉样蛋白相互作用的研究

1．4 糖胺聚糖与蛋白相互作用的分析方法

1．4．1 凝胶迁移电泳

1．4．2 核磁共振波谱

1．4．3 基于质谱的氢氘交换反应

1．5 本课题的创新点和研究意义

第二章 肝素四糖的制备及结构表征

2．1 引言

2．2 实验仪器与材料

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 肝素寡糖的制备

2．3．2 肝素四糖结构鉴定

2．3．3 淀粉样蛋白结构鉴定

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 肝素四糖的制备

2．4．2 NMR鉴定dp4s结构

2．4．3 质谱解析dp4s结构

2．4．4 鉴定Aβ40结构

第三章 淀粉样蛋白与肝素四糖相互作用的研究

3．1 引言

3．2 实验仪器与材料

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 凝胶迁移电泳

3．3．2 氢氘交换

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 肝素四糖与Aβ40的GMSA研究

3．4．2 dp4-4与Aβ40的氢氘交换质谱研究

3．4．3 对接计算模拟dp4-4与Aβ40的相互作用

第四章 结论

附表

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文