人抗凝血酶Ⅲ分离纯化工艺研究

摘要

人抗凝血酶Ⅲ(Human AntithrombinⅢ，ATⅢ)存在于人血中，是参与生理性凝血并控制凝血的重要因子，作为血液凝固系统的主要抑制剂，其所发挥的抗凝作用约占体内总抗凝物质作用的80％左右，是人体内的主要抗凝血成分。
　　ATⅢ缺乏在临床上会表现出各种临床症状，其适用于体内ATⅢ活性低于正常人水平70％以下的病人，全球范围内患有ATⅢ缺乏的人群约为正常人群的1/2000～1/5000。ATⅢ主要用于遗传性抗凝血酶缺乏和获得性抗凝血酶缺乏。目前欧洲药典、美国药典，日本药局方均已收载ATⅢ产品，而且全球主要的20个血液制品厂中已有四分之三的企业生产ATⅢ以供临床需求。然而，国内无产品上市。本研究以血浆为原料，旨在确定出ATⅢ的生产工艺，生产出符合临床患者需求的产品，将会带来巨大的社会效益与经济效益。
　　本课题的主要研究内容和成果简要介绍如下:
　　(1)分析公司目前血液制品生产工艺中各组分的ATⅢ分布情况，确定制备ATⅢ的原料。
　　通过查阅文献，对比国外该产品的工艺路线，综合考虑公司现状，通过对多批次去除冷沉淀后血浆、DEAE Sephadex-A50吸附后血浆进行效价检测，同时评估了原料的选择对公司现有产品线的影响，最终选定A50吸附后血浆，采用亲和层析捕获目标产品，可目的性获得高回收率的ATⅢ产品。同时，不影响公司整个工艺主线上人凝血因子Ⅷ(Human coagulation factorⅧ)产品及下游产品人血白蛋白(Human Albumin，HA)、静注人免疫球蛋白(Intravenousimmunoglobulin，IVIG)等的生产，能够充分利用现有资源，进一步实现血浆综合利用率的提高，一方面为企业带来经济效益同时也将产生一定的社会效益。
　　(2)经分离纯化研究和处方制剂工艺研究，最终确定了ATⅢ工艺路线，得到了高纯度的ATⅢ产品。
　　本研究从制备ATⅢ的原料到制备出原液的分离纯化研究，再经处方制剂工艺研究，采用不同的试验设计，确定原液生产各步骤的参数范围及处方制剂工艺，最终确定生产工艺路线为:血浆→离心去除冷沉淀→DEAE Sephadex-A50吸附→过滤→Capto Heparin亲和层析→超滤→有机溶剂/去污剂法(S/D)灭活病毒→Capto Q离子交换层析→超滤→纳米膜过滤→原液→配制→除菌过滤、分装→冻干→出柜，轧盖→干热病毒灭活→外观检查→入库。成品ATⅢ效价比活性高达6 IU/mg蛋白以上。
　　(3)确定ATⅢ生产工艺的最佳病毒灭活方法，并采用先进的纳米膜过滤去除病毒技术，验证其病毒灭活效果。
　　为确保血液制品的安全性，生产工艺中通常采用多种不同机制的方法联合应用。本研究最终选取了S/D处理法与干热法（冻干制品），分别用于脂包膜和非脂包膜病毒的灭活。另外采用先进的纳米膜过滤去除病毒技术，对细小病毒进行了有效的去除，进一步确保产品的安全性。病毒灭活/去除效果均委托中国医学科学院输血研究所进行预验证，病毒灭活/去除效果可达到国家相关要求。
　　(4)通过中试放大制备样品，进行质量及稳定性研究。
　　经过三批中试规模放大验证整个生产工艺的可行性，对制备的三批ATⅢ产品进行全面质量检定并与国外已上市产品进行质量对比研究，开展25℃的加速及2～8℃的长期稳定性研究。结果表明:本研究确立的生产工艺具有可行性，适合放大生产，生产出的3批产品的全部质量指标均符合拟定的质量标准要求，关键质量指标检定结果优于国外已上市的产品，加速及长期稳定性研究过程中产品稳定性良好。

目录

声明

摘要

符号说明

第1章 前言

1．1 人抗凝血酶Ⅲ简介

1．1．1 AT Ⅲ的结构特征

1．1．2 AT Ⅲ的生理功能

1．1．3 AT Ⅲ相关疾病

1．1．4 AT Ⅲ的临床应用

1．1．5 AT Ⅲ的分离纯化工艺发展史

1．2 AT Ⅲ分离纯化过程中关键检测技术

1．2．1 AT Ⅲ效价测定方法

1．2．2 AT Ⅲ肝素残留量测定方法

1．3 本课题主要研究内容及意义

第2章 AT Ⅲ分离纯化生产工艺研究

2．1 设计思路

2．1．1 起始原料

2．1．2 层析工艺

2．1．3 病毒灭活

2．1．4 质量控制

2．2 实验材料和仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 起始原料选择

2．3．2 血浆预处理方式

2．3．3 亲和层析工艺研究

2．3．4 病毒灭活研究

2．3．5 离子交换层析研究

2．3．6 纳米膜过滤

2．4 实验结果

2．4．1 起始原料选择研究结果

2．4．2 血浆预处理方式

2．4．3 亲和层析工艺研究结果

2．4．4 病毒灭活研究结果

2．4．5 离子交换层析研究结果

2．4．6 纳米膜过滤筛选结果

2．5 工艺研究小结

第3章 处方制剂工艺研究

3．1 实验材料和仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 保护剂筛选实验方法

3．2．2 冻干工艺研究方法

3．3 实验结果

3．3．1 保护剂筛选实验结果

3．3．2 冻干工艺研究结果

3．4 处方制剂工艺研究小结

第4章 中试放大及质量研究

4．1 实验材料和仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 中试规模放大

4．2．2 质量标准的拟定

4．2．3 质量对比研究

4．2．4 稳定性试验

4．3 实验结果

4．3．1 中试放大AT Ⅲ三批制品全检结果

4．3．2 拟定的质量标准

4．3．3 质量对比研究结果

4．3．4 稳定性试验结果

4．4 质量研究总结

第5章 全文总结

5．1 结果与结论

5．2 主要创新点

5．3 问题与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文