GPNMB对体外人牙髓干细胞成牙本质分化的作用研究

摘要

牙髓在牙齿萌出以后的牙齿组织再生中起着极为重要的作用。牙髓组织由外胚层间充质组成，其中含有具有可塑性和多向分化潜能的神经嵴源性间充质祖细胞，即牙髓干细胞(DPSCs，dental pulpstem cells)。当牙体组织受到创伤和不可逆性的龋病损害时，牙髓干细胞会分化成新的成牙本质细胞分泌牙本质基质，即形成所谓的修复性牙本质。从人类健康的阻生第三磨牙可轻易获得具有增殖潜能的牙髓干细胞，并且在特定条件下可以诱导表现为多能干细胞特点。在体外特定条件下，培养的牙髓干细胞具有分化成为成牙本质样细胞的能力，表现为高的克隆能力、增殖能力和形成致密钙化克隆团甚至是钙化结节的能力。因此，研究认为牙髓干细胞可应用于牙体组织再生领域。
　　牙齿的再生是由一个复杂的过程，众多的细胞因子参与了该过程的调控。跨膜非转移性黑色素瘤糖蛋白B(GPNMB，Glycoprotein(transmembrane) nonmetastatic melanoma protein b)是骨组织形成中的重要细胞因子。研究发现，作为骨诱导因子，GPNMB可以促进骨组织形成和成骨细胞的分化。那么，GPNMB是否参与了调控牙髓干细胞成牙本质分化过程尚不清楚;如果GPNMB参与了调控牙髓干细胞成牙本质分化过程，其作用尚不明确。
　　目的:
　　本研究首先分离、培养及鉴定人牙髓干细胞;在此基础上，探讨人牙髓于细胞体外诱导成牙本质分化后GPNMB的表达;然后对牙髓干细胞转染敲除GPNMB基因的siRNA，检测GPNMB mRNA和蛋白表达和增殖能力以及矿化诱导后牙髓干细胞的ALP活性和矿化相关基因（DSPP和DMP-1）的表达，探讨GPNMB在牙髓干细胞体外成牙本质分化的作用。从而为将来探讨GPNMB在DPSCs成牙本质分化中的分子学机制及牙体牙髓损伤后修复和牙组织工程技术研究奠定分子生物学基础。
　　方法:
　　1.应用酶组织块消化法从成人阻生的健康第三磨牙中分离获得牙髓干细胞，并应用有限稀释法对牙髓干细胞进行分离、培养，经细胞克隆形成实验评价其细胞克隆能力，经矿化诱导后ALP定量、茜素红染色检测成牙本质分化能力，经成脂诱导后油红O染色检测成脂能力，PCR技术检测人牙髓干细胞成牙本质分化特异性标志物DSPP和 DMP-1。
　　2.通过PCR技术和Western blot检测GPNMB在人牙髓干细胞矿化诱导后成牙本质分化中的表达。
　　3.运用RNA干扰技术，对牙髓干细胞转染敲除GPNMB基因的siRNA，应用PCR技术和Western blot检测GPNMB mRNA和蛋白的表达;及矿化诱导后牙髓干细胞的ALP活性和GPNMB矿化相关基因（DSPP和DMP-1）表达。
　　结果:
　　1.从成人阻生的健康第三磨牙牙髓组织成功分离、培养和鉴定人牙髓干细胞。
　　(1)细胞形态:培养发现细胞体积较小，相互间排列紧密，表现为典型的多形性特点，以长梭状为主。
　　(2)牙髓干细胞培养克隆形成计数为每1000个细胞有31～50clones，克隆形成率为3.1-5.0％。
　　(3)ALP碱性磷酸酶染色:矿化诱导后7天、14天，与对照组相比ALP碱性磷酸酶染色阳性，碱性磷酸酶活性增强。
　　(4)茜素红染色:矿化诱导液诱导7天后镜下可见牙髓干细胞中出现少量黄褐色结晶;至21天细胞呈复层生长，且见团块状红褐色钙化结节;定量分析显示，7、14至21天矿化结节形成量随时间延长逐渐增多，而未诱导组未见明显矿化结节形成。
　　(5)经成脂诱导后，油红O染色可见脂肪小滴形成。(6)牙髓干细胞诱导至14天成牙本质分化特异性标志物（DSPP、DMP-1）的表达，随时间升高。
　　2.牙髓干细胞矿化诱导第0、7、14天GPNMB mRNA的表达与GPNMB蛋白的表达明显升高(p＜0.05)。
　　3.培养的牙髓干细胞转染敲除GPNMB基因的siRNA后，GPNMBmRNA和蛋白的表达明显降低、增殖能力增强;而矿化诱导后牙髓干细胞的ALP活性和GPNMB矿化相关基因（DSPP和DMP-1）表达与实验组相比明显降低(p＜0.05)，表明人牙髓干细胞成牙本质分化潜能下降。
　　结论:
　　1.从成人健康阻生的第三磨牙牙髓组织中可以分离出人牙髓干细胞，细胞的形态符合人牙髓干细胞形态，并表现出良好的细胞克隆能力;经培养鉴定表现出多向分化潜能，矿化诱导后表现出成牙本质分化潜能。
　　2.GPNMB参与了人牙髓干细胞体外诱导成牙本质分化过程。
　　3.GPNMB在调节人牙髓干细胞多向分化潜能中发挥重要作用，GPNMB的欠表达可以促进人牙髓干细胞的增殖、抑制人牙髓干细胞体外向成牙本质细胞的分化，因而GPNMB是成人牙髓干细胞体外成牙本质分化中重要的细胞因子。

目录

声明

摘要

缩略语表

研究背景

第一章 GPNMB在体外人牙髓干细胞成牙本质分化中的表达

1．1 材料

1．1．1 仪器设备

1．1．2 试剂与材料

1．2 方法

1．2．1 细胞来源

1．2．2 人牙髓干细胞的分离与原代培养

1．2．3 人牙髓干细胞的扩增及纯化

1．2．4 细胞克隆形成实验

1．2．5 碱性磷酸酶活性测定成牙本质细胞／成骨能力

1．2．6 茜素红染色与定量分析鉴定成牙本质细胞／成骨能力

1．2．7 油红0染色鉴定人牙髓干细胞成脂能力

1．2．8 人牙髓干细胞成牙本质分化特异分子标记物检测

1．2．9 GPNMB在人牙髓干细胞成牙本质分化过程中的表达

1．2．10 统计分析

1．3 结果

1．3．1 细胞培养形态

1．3．2 细胞克隆形成实验

1．3．3 碱性磷酸酶(ALP)测定

1．3．4 茜素红染色与定量分析

1．3．5 成脂能力鉴定

1．3．6 人牙髓干细胞特异分子标记物表达

1．3．7 GPNMB在人牙髓干细胞分化过程中的表达

1．4 讨论

1．5 结论

附图

第二章 siRNA-6PNMB对DPSCs成牙本质细胞分化的作用

1．1 材料

1．1．1 仪器设备

1．1．2 试剂与材料

1．2 方法

1．2．1 sRNA对人牙髓干细胞GPNMB表达的影响

1．2．2 sRNA对人牙髓干细胞细胞增殖能力的影响

1．2．3 sRNA对人牙髓干细胞细胞ALP活性的影响

1．2．4 siRNA对人牙髓干细胞成牙本质分化相关基因表达的影响

1．2．5 统计分析

1．3 结果

1．3．1 siRNA对人牙髓干细胞GPNMB表达的影响

1．3．2 siRNA对人牙髓干细胞细胞增殖能力的影响

1．3．3 siRNA对人牙髓干细胞细胞ALP活性的影响

1．3．4 siRNA对人牙髓干细胞矿化相关基因表达的影响

1．4 讨论

1．5 结论

附图

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文目录

外文论文

致谢

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