丙戊酸钠通过上调miR-34a的表达抑制SMAD4在前列腺癌中的表达

摘要

前列腺癌作为一种男性恶性肿瘤，在欧美等国非常常见。近年来随着我国经济生活水平的提高，饮食及文化相关的发展，社会的老龄化及查体的普及，前列腺癌在我国的发病率呈逐年上升的趋势。前列腺癌患者发病时一般较晚，许多患者发现时已发生转移，其最常见的转移为骨转移。而研究发现前列腺癌患者的高病死率与其高转移率密切相关，因此，人们越来越关注针对前列腺癌患者转移相关的治疗。
　　上皮间质转化(EMT)是指原位肿瘤细胞，在受到物理或化学因素的作用下，从而失去了细胞极性、细胞间黏附等上皮细胞的特性，并获得间质细胞的特性时，转化成为能够向细胞外基质侵袭并向远处转移的细胞。上皮间质转化(EMT)已被证实在前列腺癌转移过程中发挥着重要作用，其调控机制由多个信号通路综合参与引导，包括TGF-β、Notch、Wnt以及ERK/MAPK等通路。其中TGF-β/SMAD4通路对肿瘤特别是晚期时的EMT发展密切相关。SMADs是哺乳动物TGF-β超家族信号传导的下游信号蛋白，它们可将TGF-β信号由细胞膜转导进入细胞核，并与DNA及一些转录因子相互作用。SMAD4即在TGF-β/SMAD4信号通路中起到关键的“渡船”的作用。因此当抑制SMAD4的表达时，可以抑制TGF-β通路信号传递，阻止上皮间质转化(EMT)在肿瘤细胞中发生。
　　近年来发现的miRNA是一组非编码小RNA，其作用涉及众多生理、病理过程，主要表现为抑制mRNA的翻译或诱导其降解，从而改变靶蛋白的表达水平。关于miRNA的研究成为当前的热点，大量研究证明miRNA在不同的肿瘤中均有不同的表达，且发挥着重要的作用:例如部分miRNA对肿瘤细胞中的EMT起促进作用，而部分miRNA对肿瘤细胞中的EMT起抑制作用。因此将来治疗肿瘤通过研究针对miRNA靶向治疗药物会有很大的发展前景。
　　目前大量的研究表明，丙戊酸钠(VPA)可抑制前列腺癌(PCa)细胞转移并且相应的下调SMAD4蛋白表达水平。然而VPA对前列腺癌细胞中SMAD4表达产生调控的过程中，是否存在miRNA的参与，这其中涉及的具体机制目前尚不清楚。如果通过实验找到影响SMAD4表达的核心miRNA，就可以针对该miRNA的作用机制研究相关的药物治疗。这种针对性更强的治疗可能会效果更好且可以减少并发症，对前列腺癌的治疗将有着重要的意义。
　　目的：
　　前期研究已证实丙戊酸钠(VPA)可抑制前列腺癌(PCa)细胞转移，并且能通过下调SMAD4表达水平阻断EMT的发生。通过本实验，我们研究丙戊酸钠(VPA)通过何种途径下调SMAD4蛋白表达水平，寻找是否存在相关的miRNA与其调控密切相关，找到这种miRNA并探索能否通过该miRNA的调控，改变SMAD4的表达水平，从而确定其是否在SMAD4的表达过程中起到关键作用，为前列腺癌的治疗寻找新的治疗靶点。
　　方法：
　　我们通过使用www.targetscan.com查找可以与SMAD4互补结合miRNAs，然后通过在PubMed上搜索及进行文献复习确定与VPA相关的miRNA，将同时与SMAD4及VPA相关的miRNA作为我们的研究对象。
　　实验设计首先培养两种前列腺癌细胞株(PC3、LNCaP)，在应用VPA处理后，检测SMAD4的蛋白和mRNA水平有无变化，变化有无统计学差异。再次用VPA处理前列腺癌细胞株，观察是否对作为研究对象的miRNA表达水平产生影响。选择应用VPA处理后的变化有统计学差异的miRNA进行下一步实验。通过质粒转染技术，分别植入转染相应miRNA前体及miRNA抑制剂后，检测其对前列腺癌细胞中SMAD4表达的影响。选出对SMAD4表达产生有统计学意义影响的miRNA作为最终目标。最后将通过相应的miRNA抑制剂将选出的目标miRNA的表达进行抑制，观察其能否消除VPA对SMAD4的影响，以评价其是否在VPA抑制SMAD4的表达过程中起到关键的作用。
　　结果：
　　通过使用www.targetscan.com查找可以与SMAD4互补结合miRNAs，然后通过在PubMed上搜索及文献复习确定与VPA相关的miRNA，我们将同时与SMAD4及VPA相关的5种miRNA作为我们的研究对象进行实验，分别是miR-20a，miR-34a，miR-124a,miR-144和miR-449a。
　　我们通过实验再次验证在经过VPA处理后，前列腺癌细胞株中SMAD4的mRNA和蛋白的水平均明显下调，且具有明显的浓度依赖性。之后我们用VPA处理前列腺癌细胞株，从初步筛选的5种miRNA中，发现miR-20a、miR-34a与miR-449a的表达水平在VPA处理后增加且具有统计学意义，而对miR-124a，miR-144的表达则无明显变化。因此我们将miR-20a、miR-34a与miR-449a作为下一步的研究目标。
　　我们通过质粒转染技术，在两种前列腺癌细胞株(LNCaP、PC3 cells)中分别植入转染miR-20a、miR-34a与miR-449a前体及miR-20a、miR-34a与miR-449a抑制剂后，发现通过转染pre-miR-34a降低SMAD4的表达，而转染pre-miR-20a或者pre-miR-449a则均增加了SMAD4的表达，且SMAD4表达的变化均有统计学差异;而通过转染miR-34a抑制剂，增加了SMAD4的表达;而转染miR-20a或者miR-449a抑制剂，则均减少了SMAD4的表达。在前列腺癌细胞株LNCaP中，通过转染miR-34a抑制剂后SMAD4表达的变化有统计学差异，而转染miR-20a抑制剂或者miR-449a抑制剂后SMAD4表达的变化无统计学差异。在前列腺癌细胞株PC3 cells中，通过转染pre-miR-34a抑制剂、pre-miR-20a抑制剂、pre-miR-449a抑制剂后SMAD4表达的变化均有统计学差异。通过实验我们发现转染miR-34a的前体及抑制物均能对SMAD4的蛋白及mRNA表达水平有显著的影响，miR-34a在VPA影响SMAD4表达过程中应该起到重要作用，因此我们选择miR-34a作为研究对象进入下一组实验。
　　在两种前列腺癌细胞株(LNCaP、PC3 cells)中，通过转染pre-miR-34a抑制剂来增加SMAD4蛋白水平的表达，然后再加用VPA处理，SMAD4蛋白水平并没有明显改变，无统计学差异。同时在两种前列腺癌细胞株(LNCaP、PC3 cells)中，应用转染pre-miR-34a抑制剂后再应用VPA处理，SMAD4的mRNA水平的变化也无统计学差异。结果表明降低miR-34a的表达可消除VPA对SMAD4的抑制效果。即上调miR-34a水平可模拟SMAD4被VPA抑制时的效果，而下调miR-34a的水平消除VPA在前列腺癌细胞的影响。
　　结论：
　　丙戊酸钠(VPA)可上调miR-20a，miR34a，miR449a在前列腺癌细胞株LNCaP和PC3中的表达水平。
　　抗癌miRNA中的miR-449a在经过VPA治疗后其表达明显上调，这提示miR-449a可能参与VPA的其它复杂的作用机制。
　　pre-miR-20a或pre-miR-449a转染诱导了SMAD4蛋白水平上调，这可能主要是由于间接的影响。VPA作用下miR-34a表达增强可隐藏miR-20a和miR-449a对SMAD4的表达效果。
　　miR-34a是在VPA抑制SMAD4的表达过程的一个关键调节因子。VPA通过上调miR-34a的表达，从而抑制了SMAD4的表达。

目录

声明

摘要

符号说明

前言及背景

1、上皮间质转化(EMT)与肿瘤之间的关系

1．1 EMT的定义及特征

1．2 EMT的调控机制

1．3 微环境改变对EMT的影响

1．4 从EMT入手针对肿瘤的治疗进展

2．丙戊酸钠(VPA)与前列腺癌的关系

3．MicroRNA(miRNA)在肿瘤调控、诊断治疗中的作用

3．1 MicroRNA(miRNA)的定义及生物学特征

3．2．MicroRNA(miRNA)的作用机制

3．3．MicroRNA(miRNA)与肿瘤的密切关系

3．4．MicroRNA(miRNA)在EMT过程中的作用

3．5．MicroRNA(miRNA)在前列腺癌中的作用

3．6 肿瘤调控相关部分miRNA

材料和方法

1．实验中常规材料设备的准备

1．1 细胞的采集及培养的材料

1．2 试剂和耗材的准备

1．3 主要仪器的准备

2．各种试剂的配置及实验具体方法

2．1 溶液配置

2．2 细胞培养

2．3 Western blotting检测各组细胞实验中SMAD4蛋白的表达

2．4 运用实时荧光定量RT-PCR检测mRNA及miRNA

2．5 细胞质粒的转染

3．具体实验方法的设计

3．1 运用生物信息学方法寻找相关的miRNA

3．2 测定VPA处理后的SMAD4的蛋白和mRNA水平的变化

3．3 实验验证VPA对通过生物信息学方法寻找相关的miRNA在的影响

3．4 通过转染技术找出可影响SMAD4表达的miRNA

3．5 通过转染miRNA抑制剂，观察能否消除VPA对SMAD4表达的影响

4．统计学分析

结论

1．找到实验对象miRNA

2．VPA抑制SMAD4的表达

3．VPA上调miR-20a，34a，and 449a的表达

4 MiR-34a抑制SMAD4的表达

5 调低miR-34a的表达可消除VPA对SMAD4的抑制效果

讨论

小结

参考文献

致谢

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