SIRT6在胃癌中的表达变化及其机制研究

摘要

目的：
　　胃癌作为常见的消化道恶性肿瘤，其死亡数量约占所有癌症死亡人数的8％。我国是胃癌的高发国家，胃癌患者的五年生存率不到20％。尽管新型综合治疗模式如介入治疗、分子靶向治疗的应用可在一定程度上改善胃癌患者的预后，提高其生存率，但临床随访调查显示胃癌患者仍有着较高的死亡率。伴随分子生物学的发展，人们日渐认识到转录信号分子及其相关调控因子在癌症发生发展过程中有着重要作用，因此寻找胃癌进展过程中调控因子，明确其可能的作用机制和途径，对改善胃癌预后，提高患者生存率有着重要意义。
　　Sirtuin是NAD+依赖型第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)，广泛分布于机体中[1]。研究证实Sirtuin蛋白可通过调控基因稳定性及肿瘤细胞能量代谢、改变肿瘤微环境等多种途径影响肿瘤细胞的增殖分化迁移。SIRT6作为Sirtuin蛋白中的一员，体外及临床研究显示它可能具有一定的抑癌作用，查阅The Cancer Genome Atlas数据库结果显示约20％肿瘤患者可出现SIRT6表达缺失，但也有研究认为在胰腺癌及乳腺癌中SIRT6具有致瘤作用。目前对SIRT6在肿瘤发生过程中的可能作用尚无明确定论，关于SIRT6在肿瘤发生发展中基础性及应用性研究较为匮乏，尤其是SIRT6在胃癌发生发展过程中的作用仍是空白，因此需进一步的探讨。
　　“Warburg效应”作为肿瘤细胞能量代谢的主要特征，表现为有氧糖酵解、脂肪酸合成及谷氨酰胺分解能力的增强，以保证肿瘤细胞生长增殖迁移等过程中必需的物质和能量的供应。研究认为“Warburg效应”的发生与肿瘤细胞内多种抑癌因子及原癌因子表达水平密切相关，这些抑癌因子及原癌因子参与了肿瘤细胞代谢途径的再编程。SIRT6作为机体代谢功能的关键调控因子，特异性敲除肝脏SIRT6可导致小鼠糖酵解能力的增强，线粒体呼吸能力减弱，证实SIRT6对机体代谢功能的调控作用与抑制糖酵解，促进氧化磷酸化，维持机体糖内稳态有关。缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是细胞代谢途径转换过程中重要的调控因子，其可影响多种糖酵解相关酶如PFK1、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter1，Glut1)等表达，研究显示SIRT6缺陷小鼠退行性变化与HIF1α介导的代谢途径转换有关。由此我们推测SIRT6可通过影响HIF-1α表达调控Warburg效应，最终实现对肿瘤细胞分化增殖活性的调控。因此本研究拟探讨SIRT6在胃癌发生发展过程中可能作用展开研究:1.明确胃癌患者病灶组织及癌旁正常组织中SIRT6和HIF-1α表达水平，分析其与胃癌患者临床特征的相关性;2.明确胃癌患者病灶组织及癌旁正常组织中糖酵解相关酶的表达水平，分析其与SIRT6和HIF-1α表达水平相关性;3.构建SIRT6过表达SGC7901细胞，分析SIRT6过表达后SGC7901糖酵解的变化情况，明确其可能的作用机制。
　　方法：
　　1.SIRT6及HIF-1α在胃癌组织及癌旁组织中的表达
　　选取2013-2015年间，在山东省立医院东院消化内科接受诊断及治疗、病理学确诊为胃癌的患者标本共40例，设置对照组和病灶组，对照组取胃癌病灶周边健康胃组织，采集时对照组样本与癌组织距离不得小于5 cm;病灶组为胃癌组织。免疫组化技术检测胃癌病灶组织中SIRT6及HIF-1α的分布及表达，RT-PCR和Western-blot法测定SIRT6及HIF-1α表达情况，分析其与胃癌患者临床特征指标的相关性。
　　2.胃癌组织及癌旁组织糖酵解水平及与SIRT6、HIF-1α相关性分析
　　RT-PCR法测定胃癌组织及癌旁正常组织糖酵解相关代谢酶HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表达水平，分析SIRT6及HIF-1α与HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表达水平的相关性。
　　3.SIRT6对胃癌细胞株SGC7901糖代谢功能的影响及机制探讨
　　利用胃癌细胞株SGC7901建立SIRT6过表达模型(pSIRT6)，同时转染pcDNA3.1(+)空载体设为对照组(pVector)，测定SIRT6过表达SGC7901细胞株的增殖活性，TUNEL法检测细胞凋亡水平，明确SIRT6过表达SGC7901细胞糖摄入及乳酸分泌能力，Western-blot法分析SIRT6过表达细胞内HIF-1α表达水平，RT-PCR法测定HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表达水平。
　　结果：
　　1.免疫组化检测胃癌患者病灶组织及癌旁正常组织内HIF-1α及SIRT6表达结果显示，HIF-1α及SIRT6主要分布于细胞核内，胃癌患者组织中SIRT6阳性率明显低于癌旁正常组织组;与癌旁正常组织相比，胃癌患者组织内HIF-1α阳性率明显增高（P＜0.05）;与癌旁正常组织相比，胃癌患者病灶组织内SIRT6 mRNA及蛋白表达水平表现为不同程度的降低，而HIF-1α的表达水平则明显上调(P＜0.05)。
　　2.HIF-1α表达水平与胃癌患者肿瘤大小、淋巴结转移、组织病理分级、临床TNM分期及浸润深度相关，但与患者年龄、性别无相关性;SIRT6表达水平与胃癌患者淋巴结转移、组织病理分级、临床TNM分期及浸润深度相关，但与患者年龄、性别及肿瘤大小无相关性。
　　3.Pearson correlation分析显示胃癌组织中HIF-1α与SIRT6表达密切相关(P＜0.05)。
　　4.40例胃癌患者中HK、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表达上调病例数分别为27例、25例、29例和29例，占所有病患人数的67.5％、62.5％、72.5％和72.5％，与癌旁正常组织相比，病灶组织内HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表达水平明显升高(P＜0.05);Pearson correlation分析显示SIRT6与HK2、PDK1、LDH5和Glut1mRNA表达水平呈负相关性，其R2值分别为0.6493、0.4082、0.6169和0.2667(P＜0.05); HIF-1α与HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表达水平呈正相关性，其R2值分别为0.3717、0.3075、0.5025和0.1892(P＜0.05)。
　　5.SGC7901细胞转染pcDNA3.1(+)SIRT6质粒建立SIRT6过表达模型，CCK-8试剂盒分析SIRT6过表达SGC7901细胞增殖活性，结果显示SIRT6过表达后可抑制SGC7901细胞的增殖活性，而pVector组和Parental组内SGC7901细胞增殖活性无明显差别。
　　6.TUNEL法分析SIRT6过表达后SGC7901细胞凋亡情况，结果显示pVector和Parental组内未检测到凋亡细胞，pSIRT6组内凋亡细胞个数为32.60±2.54，与pVector和Parental组相比pSIRT6组凋亡细胞数目显著增加(P＜0.05)。
　　7.SIRT6过表达后SGC7901细胞的葡萄糖利用能力减弱，与pVector和Parental组相比，培养上清液中葡萄糖的相对含量增加(P＜0.05)。乳酸作为衡量糖酵解活性的关键指标，SIRT6过表达后SGC7901细胞中乳酸合成能力降低(P＜0.05)，上清液中乳酸含量明显减少，表明SIRT6过表达可抑制胃癌SGC7901细胞糖酵解能力。
　　8.SIRT6过表达后，SGC7901细胞中HK2、LDH5和Glut1mRNA表达水平均发生不同程度的下调(P＜0.05)，但PDK1表达水平却未发生明显改变，提示SIRT6过表达后可通过影响糖酵解关键酶的表达水平实现对糖酵解途径的调控。
　　9.Western-blot法分析SIRT6过表达SGC7901细胞中HIF-1α表达水平，与pVector和Parental组相比，SIRT6过表达SGC7901细胞中HIF-1α表达水平显著降低(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.胃癌组织中SIRT6阳性率明显低于癌旁组织组，SIRT6表达水平与淋巴结转移、组织病理分级、临床TNM分期及浸润深度相关，但与患者年龄、性别及肿瘤大小无相关性。胃癌组织中HIF-1α阳性率明显高于癌旁组织组，与肿瘤大小、淋巴结转移、组织病理分级、临床TNM分期及浸润深度相关，但与患者年龄、性别无相关性。Pearson correlation分析结果证实胃癌组织中HIF-1α与SIRT6表达水平密切相关。
　　2.胃癌患者病灶组织内HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织。SIRT6与HK2、PDK1、LDH5和Glut1mRNA表达水平呈负相关性。HIF-1α与HK2、PDK1、LDH5和Glut1 mRNA表达水平呈正相关性。
　　3.SIRT6过表达可抑制胃癌细胞SGC7901增殖活性，促进其凋亡，它可通过影响HIF-1α下调胃癌细胞SGC7901多种糖代谢酶的表达，进而影响SGC7901细胞的糖摄入和乳酸生成能力。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 SIRT6及HIF-1α在胃癌组织及癌旁组织中的表达

1 临床资料与分组

2 样本采集

3 试剂与材料

4 实验方法

5 结果

6 结论

7 讨论

8 图表

第二部分 胃癌及癌旁组织糖酵解水平与SIRT6、HIF-1α相关性分析

1 临床资料与分组

2 样本采集

3 试剂与材料

4 实验方法

5 结果

6 结论

7 讨论

8 图表

第三部分 SIRT6对胃癌细胞株SGC7901糖代谢功能的影响及机制探讨

1 试剂与材料

2 实验方法

3 结果

4 结论

5 讨论

6 图表

结论

参考文献

综述 Sirtuin在肿瘤发生发展中机制研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文

学位论文评阅及答辩情况表

外文论文1

外文论文2