内质网应激在高尿酸诱导的血管内皮细胞损伤中的作用及机制研究

摘要

本文分为两个部分进行探讨：
　　第一部分 不同浓度尿酸对体外原代培养的血管内皮细胞活性及功能的影响
　　目的：
　　1.体外原代培养人脐静脉内皮细胞，建立尿酸损伤的细胞模型。
　　2.验证不同浓度尿酸对体外培养的血管内皮细胞活性的影响，筛选出能够导致内皮细胞损伤的尿酸浓度。
　　方法：
　　1.细胞培养
　　原代培养的HUVECs购自德国PromoCell公司，采用内皮细胞生长培养基(EGM)进行传代培养，每日相差倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，选取生长良好的的3-5代细胞用于实验。
　　2.细胞鉴定
　　将HUVEC传代至激光共聚焦专用培养皿，24h后免疫荧光染色及流式细胞仪检测细胞表面标记物Von Willebrand factor(vWF)、CD31及Smooth muscle alpha-actin(α-SMA)的表达，对原代培养细胞进行鉴定。
　　3.细胞增殖检测
　　将HUVEC传代至96孔板，24h后更换含有不同浓度尿酸的培养液(0mg/dl、4mg/ml、6mg/ml、9mg/ml、12mg/ml)，诱导12h、24h及48h时，MTT法检测细胞增殖情况。
　　4.细胞凋亡检测
　　将HUVEC传代至6孔板，24h后更换含有不同浓度尿酸的培养液(4mg/ml、6mg/ml、9mg/ml、12mg/ml)，分别在尿酸诱导前及诱导后12h、24h及48h收集细胞，利用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒对细胞进行染色，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
　　5.NO含量检测
　　将HUVEC传代至6孔板，24h后更换含有不同浓度尿酸的培养液(4mg/ml、6mg/ml、9mg/ml、12mg/m1)，分别在尿酸诱导前及诱导后12h、24h及48h收集细胞培养的上清液，硝酸还原酶法测定细胞培养液上清中NO的含量。
　　6.统计学分析
　　本文实验数据均以mean±SD表示。采用SPSS19.0软件行One-wayANOVA分析，组间两两比较采用SNK-q test分析，以P＜0.05作为差异有显著意义，P＜0.01作为差异有高度显著性意义。
　　结果：
　　1.人脐静脉内皮细胞的体外原代培养及鉴定
　　体外原代培养的HUVEC形态不规则、扁平、呈椭圆形、梭形或多角形，细胞单层融合时呈典型“铺路石”样外观，体外传代至第6代时，细胞形态及生长规律未见明显变化。免疫荧光染色及流式细胞仪检测结果均显示原代培养的HUVECs中内皮细胞标志物vWF及CD31表达阳性，成纤维细胞标志物α-SMA表达阴性，符合内皮细胞特征。
　　2.不同浓度尿酸对细胞增殖的影响
　　MTT结果显示，与对照组比较，4mg/dl及6mg/dl尿酸刺激后12h、24h及48h细胞增殖均未见明显变化，9mg/dl尿酸刺激48h出现细胞增殖能力下降，12mg/dl尿酸刺激24h开始出现细胞增殖能力下降。
　　3.不同浓度尿酸对细胞凋亡的影响
　　凋亡检测结果显示，与对照组比较，4mg/dl尿酸刺激12h、24h及48h细胞凋亡均未见明显变化，6mg/dl尿酸刺激48h细胞凋亡增加，9mg/dl尿酸刺激24h开始出现细胞凋亡增加，12mg/dl尿酸刺激12h即出现细胞凋亡增加，且呈时间依赖性增加。
　　4.不同浓度尿酸对细胞NO生成能力的影响
　　NO检测结果显示，与对照组比较，4mg/dl尿酸刺激后各个时间点细胞上清液中NO含量均未见明显变化，6mg/dl尿酸刺激48h细胞上清液中NO含量减少，9mg/dl及12mg/dl尿酸刺激后12h均开始出现细胞上清液中NO含量减少，且呈时间依赖性减少。
　　结论：
　　1.在体外培养的原代HUVEC中，4mg/dl尿酸对细胞凋亡及增殖无明显影响。
　　2.浓度高于6mg/dl时尿酸可呈浓度及时间依赖性的诱导凋亡并抑制HUVEC增殖。
　　3.浓度高于6mg/dl时尿酸呈浓度及时间依赖性的诱导HUVEC NO生成减少，导致内皮细胞功能障碍。
　　第二部分 内质网应激在高浓度尿酸诱导的血管内皮细胞功能障碍中作用的研究
　　目的：
　　1.观察高浓度尿酸诱导后细胞内ROS含量、内质网应激标志物的表达，探讨氧化应激、内质网应激在尿酸诱导的内皮细胞损伤中的作用。
　　2.检测高浓度尿酸诱导后NO生成相关因子及信号通路的表达变化，并探讨高尿酸导致内皮细胞功能障碍的机制。
　　方法：
　　1.尿酸诱导及药物预处理
　　体外原代培养的HUVECs接种培养板后24h，更换含有尿酸的EGM，分别置入37℃细胞培养箱内继续培养不同时间。进行药理学干预时，在尿酸诱导前分别给予氧清除剂PEG-SOD(100U/ml)、内质网应激缓解剂4PBA(10 mM)及PKC抑制剂polymyxin B(20μg/ml)预处理30min，在尿酸诱导后不同时间分别收集细胞。
　　2.细胞内ROS含量的检测
　　体外原代培养的HUVECs接种培养板后24h，更换含有12mg/dl尿酸的EGM，分别置入37℃细胞培养箱内继续培养3h、6h、12h、24h，利用特异性CM-H2DCFDA探针检测细胞内ROS含量。
　　3.Western blotting检测
　　HUVECs接种培养板后24h，更换含有12mg/dl尿酸的EGM，分别在培养3h、6h、12h、24h时收集细胞，提取细胞总蛋白，western blotting检测CHOP、ATF-6、Caspase-12、eNOS、PKC蛋白表达，及eNOS、PKC的磷酸化水平。
　　4.免疫沉淀法检测eNOS/CaM的相互作用
　　HUVECs接种培养板后24h，更换含有12mg/dl尿酸的EGM，分别在培养3h、6h、12h、24h时收集细胞，提取细胞总蛋白，利用eNOS抗体与抗原结合，并与protein A琼脂糖珠耦联后沉淀的原理，使eNOS及与之结合的蛋白共同沉淀，联合western blotting可以柃测出与eNOS结合的CaM蛋白含量，间接反应eNOS/CaM的相互作用。
　　5.胞浆钙离子浓度检测HUVECs接种培养板，尿酸诱导3h、6h、12h、24h时，采用钙离子特异性荧光探针Fluo-3 AM染色，荧光显微镜下观察胞浆内钙离子浓度变化。
　　6.eNOS活性及NO生成的检测
　　尿酸诱导前分别给予活性氧清除剂PEG-SOD，内质网应激缓解剂4PBA，PKC抑制剂polymyxin B预处理，尿酸诱导48h收集细胞及细胞培养的上清液，对细胞内eNOS活性及细胞上清液中NO含量进行检测。
　　结果：
　　1.高浓度尿酸对细胞内ROS生成的影响
　　与对照组比较，高浓度尿酸(12mg/dl)刺激后3h开始检测到细胞内ROS生成增多，在12h达到高峰，24h时持续高表达。100U/ml PEG-SOD预处理能有效抑制尿酸导致的ROS生成增加。
　　2.高浓度尿酸对细胞内质网应激的影响
　　结果显示，与对照组比较，尿酸诱导后6h开始检测到细胞内质网应激标志物ATF-6、CHOP表达增加，在12h达到高峰;12h开始检测到内质网途径凋亡因子caspase-12表达增加，24h达到高峰。PEG-SOD(100U/ml)及4PBA(10 mM)均能有效抑制UA诱导的ATF6、CHOP及caspase12表达增加。
　　3.氧清除剂及内质网应激抑制剂拮抗尿酸导致的细胞凋亡及NO生成减少
　　结果显示，与对照组比较，UA(12mg/dl)刺激48h后，细胞凋亡明40显增加、NO生成明显减少;抗氧化剂PEG-SOD(100U/ml)及内质网应激抑制剂4PBA(10 mM)均可有效抑制UA导致的凋亡增加及NO生成减少
　　4.尿酸通过增加Thr495位点的磷酸化降低eNOS活性
　　尿酸刺激后各个时间点，细胞内CaM蛋白表达量、胞浆钙离子浓度、eNOS总蛋白表达量均未见明显改变。进一步对eNOS的磷酸化水平进行检测，结果显示尿酸刺激后eNOS-Ser1177位点的磷酸化水平无明显变化，eNOS-Thr495位点的磷酸化水平明显增加。免疫沉淀结果显示，尿酸刺激后与eNOS结合的CaM明显减少，提示eNOS/CaM的相互作用减弱。
　　5.尿酸通过内质网应激/PKC信号通路降低eNOS活性
　　结果显示:PKC总蛋白含量在尿酸刺激后6h，12h及24h均无明显变化，p-PKC蛋白含量在尿酸刺激6h开始增加，12h达到高峰;PEG-SOD、4PBA预处理可有效抑制UA诱导的PKC磷酸化增加。PEG-SOD、4PBApolymyxin B均能够抑制UA诱导的eNOS Thr495位点的磷酸化水平增加及eNOS活性下降。
　　结论：
　　1.高尿酸可诱导HUVEC发生氧化应激，并启动内质网应激的发生，诱发内质网途径的细胞凋亡。
　　2.高尿酸诱导后HUVEC内eNOS在Thr495位点磷酸化增加，降低eNOS与CaM的相互作用，导致eNOS活性下降，NO释放减少。
　　3.高尿酸诱导的内质网应激通过激活PKC信号通路调控eNOS活性。
　　4.内质网应激抑制剂能够有效拮抗高尿酸诱导的内皮细胞功能障碍。

目录

声明

摘要

符号说明

论文Ⅰ 不同浓度尿酸对体外原代培养的血管内皮细胞活性及功能的影响

1．引言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

5．创新点、限制性

6．结论

附图表

参考文献

摘要

符号说明

论文Ⅱ 内质网应激在高浓度尿酸诱导的血管内皮细胞功能障碍中作用的研究

1．前言

2，材料与方法

3．结果

4．讨论

5．创新点、限制性

6．结论

附图表

参考文献

致谢

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