PDCD4基因在多囊卵巢综合征患者中的表达及其相关性研究

摘要

目的：
　　1.通过比较PDCD4在PCOS妇女以及对照人群中的表达状态，明确PDCD4在PCOS患者中的表达特点;
　　2.分析PDCD4表达与PCOS妇女BMI、胰岛素抵抗以及脂代谢参数的相关性;应用二甲双胍改善胰岛素敏感性后检测PDCD4表达水平的变化，阐明PDCD4表达与PCOS内分泌代谢紊乱是否存在相关性;
　　3.探讨PDCD4表达对PCOS妇女卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其作用机制。
　　方法：
　　1.病例收集
　　选取在山东大学附属生殖医院就诊的PCOS妇女77例，PCOS的诊断依据中国PCOS诊断标准;另选择月经周期正常、因输卵管因素或男方因素就诊的不孕妇女67例为对照组;所有研究对象排除Cushing综合征、甲状腺功能障碍、分泌雄激素肿瘤和Ⅰ型、Ⅱ型糖尿病，入组前3个月均未接受过任何药物或手术治疗;根据BMI分别将PCOS妇女及其对照组分成肥胖亚组（≥25kg/m2）以及非肥胖亚组(＜25kg/m2)。
　　2.实时荧光定量Real time RT-PCR检测
　　分离所有病例外周血单个核细胞，提取RNA，利用实时荧光定量Real timeRT-PCR检测PCOS妇女及其对照组PDCD4 mRNA的表达情况。
　　3.卵巢颗粒细胞分离
　　在超声探头引导下，经阴道穿刺抽吸卵泡取卵，抽吸出的卵泡液在实体显微镜下找到卵冠丘复合物，将拣卵后的卵泡液迅速转移至实验室进行颗粒细胞的洗涤纯化。
　　4.Small interfering RNA(SiRNA)转染
　　设计PDCD4-SiRNA序列，利用脂质体转染分离纯化后的PCOS妇女卵巢颗粒细胞;同时应用与PDCD4序列非同源性序列作为PDCD4-SiRNA阴性对照。
　　5.流式细胞术检测
　　PCOS妇女及对照组卵巢颗粒细胞分离纯化后，立即用AnnexinⅤ-FITC和PI(propidium iodide)凋亡检测试剂盒染色，经流式细胞仪检测分析卵巢颗粒细胞凋亡率。
　　6.TUNEL检测
　　PCOS妇女卵巢颗粒细胞分离纯化后进行PDCD4-SiRNA转染，利用TUNEL凋亡检测试剂盒染色，经激光共聚焦显微镜观察PDCD4-SiRNA转染前后卵巢颗粒细胞凋亡变化情况。
　　7.Western blot检测
　　PCOS妇女卵巢颗粒细胞分离纯化后进行PDCD4-SiRNA转染，提取细胞蛋白测定蛋白浓度后依次行SDS-PAGE电泳，转膜，抗体结合，暗室显影，观察PDCD4-SiRNA转染前后卵巢颗粒细胞凋亡信号通路分子Bax和Bcl-2的表达变化情况。
　　8.统计学分析
　　所有数据均使用SPSS统计学软件包分析，计量资料以均数±标准差表示，计数资料以数值和百分比表示;统计分析采用单因素方差、t检验、Spearman相关以及多因素回归分析;所有假设检验均进行双侧检验，P＜0.05被认为差异有统计学意义。
　　结果：
　　一、PDCD4在PCOS妇女与对照人群中的不同表达状态
　　1.PCOS患者与对照组临床特点的比较
　　PCOS患者雌二醇(E2)、总睾酮(TT)、黄体生成素(LH)、空腹胰岛素(Insulin0)、口服葡萄糖两小时后胰岛素(Insulin120)以及稳态模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显高于对照组，结果具有统计学差异(P＜0.05);PCOS妇女卵泡刺激素(FSH)明显低于对照组，结果具有统计学差异(P＜0.05);两组间年龄、BMI、甲状腺刺激素(TSH)、催乳素(PRL)、空腹血糖(Glucose0)、口服葡萄糖两小时后血糖(Glucose120)、胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)，总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)没有统计学差异。
　　2.PCOS妇女与对照组肥胖和非肥胖亚组临床特点的比较
　　PCOS妇女肥胖亚组E2、TT、LH、Insulin0、Insulin120、Glucose120以及HOMA-IR明显高于对照肥胖亚组，具有统计学差异(P＜0.05);FSH明显低于对照组，结果具有统计学差异(P＜0.05);两亚组间年龄、BMI、TSH、PRL、Glucose0、HOMA-β、TC、TG、LDL和HDL没有统计学差异。
　　PCOS妇女非肥胖亚组TSH、E2、TT以及LH明显高于对照非肥胖亚组，具有统计学差异(P＜0.05); FSH明显低于对照组，结果具有统计学差异(P＜0.05);两亚组间年龄、BMI、PRL、Insulin0、Insulin120、Glucose0、Glucose120、HOMA-IR、HOMA-β、TC、TG、LDL和HDL没有统计学差异。
　　3.PCOS妇女与对照组间及其肥胖和非肥胖亚组间PDCD4表达的比较
　　通过对PCOS妇女与对照组病例外周血单个核细胞(PBMCs)中PDCD4mRNA实时荧光定量PCR检测分析发现，PDCD4在PCOS妇女中的表达高于对照组，结果具有统计学差异(P＜0.05);PCOS妇女肥胖亚组PDCD4表达明显高于对照肥胖亚组，具有显著的统计学差异(P＜0.01);PCOS妇女与对照非肥胖亚组间PDCD4表达没有统计学差异。
　　二、PDCD4表达与PCOS妇女及其对照组糖脂代谢的相关性分析及其临床意义
　　1.PDCD4表达与体重指数(BMI)的相关性
　　PCOS妇女中PDCD4表达与BMI具有显著的相关性(r=0.52，P＜0.0001)，对于对照组PDCD4表达与BMI没有相关性。
　　2.PDCD4表达与胰岛素抵抗的相关性
　　PCOS妇女中PDCD4表达与Insulin0、Insulin120、Glucose120、HOMA-IR和HOMA-β具有显著的相关性(r=0.34，0.31，0.29，0.36，0.25;P＜0.01或者0.05);对于对照组PDCD4表达与胰岛素抵抗指标没有任何相关性。
　　针对IR的PCOS患者给予口服二甲双胍三个月治疗，通过对其PBMCs中PDCD4 mRNA实时荧光定量PCR检测发现，PDCD4在二甲双胍治疗后其表达明显降低，结果具有统计学差异(P＜0.05)。
　　3.PDCD4表达与脂代谢紊乱的相关性
　　PCOS妇女中PDCD4表达与TG具有显著的正相关性(r=0.39;P＜0.001)，PDCD4表达与HDL具有显著的负相关性(r=-0.41;P＜0.001)，对于对照组PDCD4表达与脂代谢指标没有任何相关性。
　　4.PDCD4表达与PCOS妇女发病风险的关联性分析
　　通过多因素回归分析发现，校正E2和Insulin120后，PDCD4表达对于PCOS妇女发病是独立的风险因素(相对危险系数，1.318;95％可信区间，1.021-1.703，P＜0.05)，表明PDCD4拘高表达加重了PCOS的发生和发展，是反映PCOS妇女发病的重要危险因素。
　　三、PDCD4表达对PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其作用机制
　　1.PCOS妇女与对照组卵巢颗粒细胞凋亡的对比
　　应用流式细胞术对23例PCOS妇女以及30例对照卵巢颗粒细胞检测发现，PCOS组卵巢颗粒细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0.05）。
　　2.PDCD4表达沉默前后PCOS卵巢颗粒细胞凋亡的对比
　　为了进一步证实PDCD4对于卵巢颗粒细胞促凋亡作用，通过PDCD4-SiRNA转染卵巢颗粒细胞24h后发现其凋亡率明显降低(P＜0.05)，TUNEL分析也发现凋亡细胞数量明显减少。
　　3.PDCD4表达沉默前后PCOS卵巢颗粒细胞凋亡通路信号分子表达变化
　　为了确定PDCD4表达沉默对于凋亡通路关键信号分子的影响，通过Westernblot发现，PDCD4-SiRNA转染卵巢颗粒细胞24h后Bax表达明显降低，Bcl-2表达明显升高，Bax/Bcl-2比值明显降低。
　　结论：
　　1.PDCD4在PCOS妇女中出现高表达，其中肥胖亚组PDCD4表达增强尤为显著。
　　2.PDCD4在PCOS妇女中的高表达与其肥胖指数、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱密切相关，是PCOS妇女发病的独立风险因素。二甲双胍治疗后PDCD4表达降低。
　　3.PDCD4高表达促进PCOS妇女卵巢颗粒细胞凋亡，其作用途径主要是通过Bax/Bcl-2凋亡信号通路。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 PDCD4在多囊卵巢综合征(PCOS)妇女与对照人群中的不同表达状态

1．1 前言

1．1．1 PCOS的临床表现

1．1．2 PCOS的诊断

1．1．3 PCOS相关糖脂代谢易感基因研究进展

1．1．4 PDCD4的发现和生物学特点

1．1．5 PDCD4与肥胖症以及糖脂代谢的最新研究进展

1．1．6 研究目的

1．2 资料与方法

1．2．1 研究对象

1．2．2 辅助检查

1．2．3 实验室检测

1．2．4 qRT-PCR

1．2．5 统计学分析

1．3 结果

1．3．1 PCOS妇女与对照组临床特点的比较

1．3．2 PCOS妇女与对照组肥胖和非肥胖亚组临床特点的比较

1．3．3 PCOS妇女与对照组PDCD4表达的比较

1．3．4 PCOS妇女与对照组肥胖和非肥胖亚组PDCD4表达的比较

1．4 讨论

1．5 小结

第二章 PDCD4表达与糖脂代谢的相关性分析及其临床意义

2．1 前言

2．1．1 PCOS与肥胖症

2．1．2 PCOS与胰岛素抵抗

2．1．3 PCOS与血脂异常

2．2 资料与方法

2．3 结果

2．3．1 PDCD4表达与体重指数的相关性分析

2．3．2 PDCD4表达与胰岛素抵抗的相关性分析

2．3．3 PDCD4表达与脂代谢紊乱的相关性分析

2．3．4 PDCD4表达与PCOS妇女发病风险的关联性分析

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 PDCD4表达对多囊卵巢综合征妇女卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其作用机制

3．1 前言

3．1．1 PCOS卵巢颗粒细胞凋亡研究进展

3．1．2 PDCD4对于细胞凋亡的研究进展

3．1．3 研究目的

3．2 资料与方法

3．2．1 PCOS妇女卵巢颗粒细胞的分离与培养

3．2．2 细胞凋亡的检测

3．2．3 PDCD4-siRNA转染卵巢颗粒细胞(以12孔板转染为例)

3．2．4 Western blot检测

3．2．5 统计学分析

3．3 结果

3．3．1 PCOS妇女与对照组卵巢颗粒细胞凋亡的对比

3．3．2 PDCD4表达沉默前后PCOS妇女卵巢颗粒细胞凋亡的对比

3．3．3 PDCD4表达沉默前后PCOS妇女卵巢颗粒细胞凋亡通路关键信号分子表达的对比

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 总结与展望

4．1 总结

4．2 主要创新点

4．3 展望

附表

附图

参考文献

致谢

攻读博士期间发表的学术论文

学位论文评阅及答辩情况表

外文论文1

外文论文2