泥蚶提取物海生素对Hl-60细胞增殖及诱导分化的影响

摘要

急性白血病(AL)是一种获得性造血干细胞异常造成的恶性增殖性疾病，近年来有人提出了肿瘤的诱导分化治疗。但是迫切需要寻找新的毒性小、选择性强的诱导分化剂来满足临床需要。
　　海洋中药是中药的重要组成部分，海生素(HSS)是近年来应用现代生物技术从海洋生物泥蚶软体中提取出的一种小分子糖多肽类物质，体外试验证实对肾癌细胞、白血病细胞有明显的抑制增殖作用。
　　本研究以HL-60细胞为体外分化诱导模型，观察HSS对HL-60细胞增殖及分化成熟的影响，并与最常用的诱导分化剂ATRA和AS2O3的作用进行比较，并初步探讨了其作用机制，以其希望寻找一种新的诱导分化和凋亡剂。
　　目的:
　　1.研究HSS对HL-60细胞的增殖的影响。
　　2.研究HSS对HL-60细胞凋亡、诱导分化的作用，并探讨其临床应用价值。
　　3.阐明HSS对HL-60细胞诱导分化及凋亡作用可能的机制。
　　方法:
　　1.研究HSS对HL-60细胞的增殖的影响。
　　2.研究HSS对HL-60细胞凋亡、诱导分化的作用，并同临床最常用的诱导分化剂ATRA、AS2O3在细胞增殖、细胞形态、表面分化抗原、细胞凋亡、细胞周期分布等方面进行比较，探讨其临床应用价值。
　　3.HSS对HL-60细胞诱导分化及凋亡作用可能的机制
　　结果:
　　1.HSS对HL-60细胞增殖的影响
　　HSS(0.1mg/L，1mg/L，10mg/L)12h、24h、48h、72h各时间点吸光度值与对照组比较无统计学差异（P＞0.05）;HSS(100mg/L，1000 mg/L)12h吸光度值与对照组比较无统计学差异（P＞0.05），24h、48h、72h各时间点吸光度值与对照组比较有统计学差异（P＜0.05），与0.1、1、10 mg/L组比较也有统计学差异(P＜0.05);在100、1000 mg/L浓度下12h、24h、48h、72h各个时间点之间比较有统计学差异（P＜0.05）。经Graphpad Prism5软件分析72小时HSS作用HL-60细胞的IC50为:40mg/L。
　　2.HSS对HL-60细胞凋亡、诱导分化的作用及同ATRA、AS2O3的作用进行比较
　　2.1 对HL-60细胞增殖的影响:HSS100mg/L、ATRA5umol/L、AS2O35umol/L均对HL-60细胞增殖有明显的抑制作用并呈时间效应关系。HSS组24小时、48小时、72小时增殖抑制率分别为25.23±5.13％、39.13±3.14％、70.45±8.20％;ATRA组分别为:4.56±3.31％23.20±4.32％、44.22±6.26％; AS2O3组分别为:4.25±3.82％、36.80±2.45％、73.62±7.28％。24小时时HSS组的增殖抑制率高于ATRA组、AS2O3组，差异有统计学意义(P＜0.05)。48小时、72小时时高于ATRA组(P＜0.05)，与AS2O3组比较无统计学差异（P＞0.05）。
　　2.2 光镜下细胞形态变化:对照组HL-60细胞体积大，大多为圆形或不规则椭圆形，细胞核大而圆，核仁清晰可见，染色质分散，胞浆嗜碱深染，细胞核和细胞浆比例增大;ATRA组HL-60细胞体积明显缩小，细胞核凹陷缩小，并转变为杆状核、肾形核甚至出现分叶核。核仁数量减少，染色质致密变粗。细胞核和细胞浆比例缩小，部分细胞发生凋亡;AS2O3组HL-60细胞体积缩小，细胞核凹陷缩小，部分细胞核断裂成数个大小不等的圆形颗粒，染色质嗜碱性增强，部分细胞形成凋亡小体。HSS组HL-60细胞形态表现为细胞体积明显缩小，细胞核缩小内陷，核仁数量减少，细胞核形状不规则，出现了多叶核等，细胞浆增多，核浆比例缩小，染色质变粗致密。
　　2.3 细胞表面分化抗原的变化:HSS100mg/L、ATRA5umol/L、AS2O35umol/L作用HL-60细胞72小时后，细胞表面CD11b阳性率分别为63.50±8.28％、70.65±7.20％、18.30±2.27％，对照组为6.42±4.04％，各实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05); HSS组与ATRA组比较无统计学差异(P＞0.05)，与AS2O3组比较有统计学差异(P＜0.05)。CD15在HSS组、ATRA组、AS2O3组和对照组分别为93.24±8.06％、93.58±6.28％、91.28±7.27％、96.50±7.24％，差异无统计学意义。
　　2.4 细胞凋亡率的变化:HSS100mg/L，ATRA5umol/L，AS2O35umol/L作用HL-60细胞72小时后，凋亡率分别为:38.90±3.24％、40.34±4.25％、38.18±7.20％，对照组为5.10±4.20％。各实验组与对照组相比均有统计学差异(P＜0.05)。HSS组与ATRA、AS2O3组比较均无统计学差异（P＞0.05）。
　　2.5 细胞周期分布:经HSS100mg/L作用HL-60细胞72小时后G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例分别为:67.8±5.2％、26.5±3.8％5.7±2.0％，对照组为40.1±4.0％、50.2±1.4％、9.7±2.6％。HSS组大部分细胞停留在G0/G1期，S期细胞明显减少，G2/M期细胞相对减少。HSS组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。ATRA组分别为:76.0±3.9％、18.7±2.3％、5.3±1.2％，As2O3组分别为72.9±2.7％、20.1±1.9％、7.0±1.5％;100mg/LHSS组与5μM ATRA组比较，G0/G1期细胞所占比例低(P＜0.05)，与5μM AS2.O3组比较无统计学差异(P＞0.05)。
　　3.HSS对HL-60细胞诱导分化及凋亡作用可能的机制
　　3.1 经HSS100mg/L作用HL-60细胞72小时后，HSS组HL-60细胞bcl-2基因mRNA相对表达量为0.68±0.06，对照组为0.89±0.12，HSS组bcl-2基因表达减弱，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;AS2O3组、ATRA组bcl-2基因表达也减弱，分别为0.81±0.16和0.73±0.29，但与对照组比较差异并无统计学意义(P＞0.05)，HSS组同AS2O3组、ATRA组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）;HSS组、AS2O3组、ATRA组bax基因mRNA相对表达量分别为:0.89±0.15,0.50±0.05，0.89±0.06，对照组为0.18±0.07;各实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。HSS组同ATRA组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但同AS2O3组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，要高于AS2O3组。
　　3.2 HSS组、AS2O3组、ATRA组mpo基因mRNA相对表达量分别为:0.44±0.14、0.86±0.08、0.83±0.15，对照组为0.95±0.17;各实验组mpo基因表达减弱，与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。最明显的是HSS组，其次为ATRA组和AS2O3组;HSS组与ATRA组、AS2O3组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.3 Western blotting结果显示，HSS组、ATRA组、AS2O3组bcl-2蛋白表达量分别为:0.45±0.09、0.36±0.11、0.39±0.15，对照组为0.76±0.08，各实验组bcl-2蛋白表达显著低于对照组(P＜0.05)。HSS组、ATRA组、AS2O3组bax蛋白表达量分别为:0.70±0.12、0.74±0.10、0.69±0.09，对照组为0.35±0.10，各实验组bax蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05）。bcl-2蛋白和bax蛋白表达在各实验组之间比较，差异无统计学意义(P＞0.05);
　　结论:
　　1.低浓度HSS对HL-60细胞无增殖抑制作用;较高浓度HSS24小时后对HL-60细胞增殖有明显的抑制作用并呈时间、剂量效应关系。
　　2.HSS对HL-60细胞还有诱导细胞凋亡和分化的作用。其诱导HL-60细胞凋亡及分化的能力在某些方面同ATRA、AS2O3类似，甚至优于ATRA、AS2O3;
　　3.HSS诱导HL-60细胞凋亡及分化的机制可能涉及bcl-2/bax基因。
　　4.HSS在有可能成为新的白血病诱导分化剂而应用于临床。当然这也需要进一步的实验特别是体内实验证实。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 泥蚶提取物HSS对HL-60细胞增殖及诱导分化的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 泥蚶提取物海生素抑制HL-60细胞增殖及诱导分化的机制

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

综述：诱导分化剂及其机制研究进展

致谢

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