肿瘤相关巨噬细胞在增强前列腺癌细胞上皮-间质转化和侵袭性的机制研究

摘要

研究背景:
　　前列腺癌(prostate cancer, PCa)是影响西方国家男性的最常见的癌症，在2016年，仅在美国就会有超过18万个前列腺癌新发病例，占所有新发癌症的五分之一以上。全世界每年由癌症引起的近800万死亡病例中的90％以上主要是癌症的转移扩散造成的，转移是一种复杂的多步骤过程，通过该过程癌细胞从原发性肿瘤扩散到周围组织和远端器官。在肿瘤进展期间，单核细胞和巨噬细胞募集到肿瘤周围，从而改变肿瘤微环境以加速肿瘤的进展，从肿瘤和基质细胞产生的各种微环境信号可促使巨噬细胞改变它们的功能表型。巨噬细胞可分为两种:经典M1型和M2型巨噬细胞，M1型巨噬细胞是参与炎症反应和抗肿瘤免疫的关键，相反，M2型巨噬细胞则影响抗炎效果并有促肿瘤活性。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAM)表现出与M2型巨噬细胞相似的功能，并且是肿瘤微环境的关键调节剂。在肿瘤晚期，TAM为肿瘤生长、存活和血管生成提供有利的微环境，产生多种促炎细胞因子，如IL-6，其参与肿瘤细胞周期凋亡和抑制重要基因的诱导。诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是M1型巨噬细胞的特异性标记物，而精氨酸激酶-1(arginase-1，Arg-1)是TAM的特异性标记物。
　　在肿瘤微环境中，巨噬细胞是最丰富的炎症细胞。肿瘤细胞及其周围细胞在其微环境中的相互作用对于肿瘤的恶性进展发挥至关重要的作用。因此我们假想，在微环境中，肿瘤细胞分泌的相关因子可使M1型巨噬细胞向M2型极化(TAMs)，同时，TAMs可能促进了肿瘤的侵袭性与进展速度。
　　目的:
　　探讨肿瘤相关巨噬细胞与前列腺癌细胞在微环境中相互作用对前列腺癌侵袭与进展的机制。
　　方法:
　　1.培养人前列腺癌细胞PC-3、C4-2细胞，培养小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，利用共培养技术将PC-3细胞与RAW264.7细胞共同培养24h，PBS作为对照组;将C4-2细胞与RAW264.7细胞共同培养24h，PBS作为对照组。
　　2.利用Western blot技术观察PC-3细胞对RAW264.7细胞、C4-2细胞对RAW264.7细胞影响，检测M1特异性指标iNOS、M2特异性指标Arg-1的蛋白水平表达量。
　　3.利用Western blot技术观察PC-3细胞、C4-2细胞对巨噬RAW264.7细胞中AMPK、p-AMPK、mTor、p-mTor的蛋白水平表达量。
　　4.利用细胞免疫荧光染色技术观察PC-3细胞、C4-2细胞对RAW264.7细胞中iNOS、Arg-1的蛋白水平表达量。
　　5.利用Transwell迁移侵袭实验、细胞划痕实验观察RAW264.7细胞对PC-3细胞、C4-2细胞的侵袭与转移能力。
　　6.利用Western blot技术观察RAW264.7细胞对PC-3细胞、C4-2细胞中上皮间质转化(EMT)指标(E-cadherin、N-Cadherin、Vimentin)和侵袭能力指标Icam-1的蛋白水平表达量。
　　结果:
　　1.小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞与人前列腺癌细胞PC-3、C4-2细胞共培养24h后，细胞形态发生了明显变化，巨噬细胞由圆形小细胞形成多角的大细胞、长梭形细胞。
　　2.Western blot结果显示，与PBS对照组相比，PC-3细胞和C4-2细胞对RAW264.7细胞作用24h后，iNOS的蛋白表达量下降，Arg-1的蛋白水平表达量增加。
　　3.Western blot结果显示，与PBS对照组相比，PC-3细胞和C4-2细胞对RAW264.7细胞作用24h后，p-AMPK的蛋白表达量增加、p-mTor的蛋白水平表达量减少。
　　4.细胞免疫荧光结果显示，与PBS对照组相比，PC-3细胞和C4-2细胞对RAW264.7细胞作用24h后，iNOS的蛋白表达量下降，Arg-1的蛋白水平表达量增加。
　　5.Transwell结果显示，与PBS对照组相比，RAW264.7细胞对PC-3细胞和C4-2细胞作用24h后，迁移细胞数量明显增加，细胞的迁移运动能力增加;细胞划痕实验结果显示，与PBS对照组相比，RAW264.7细胞对PC-3细胞、C4-2细胞作用24h后，细胞的迁移速度明显增加。
　　6.Western blot结果显示，与PBS对照组相比，RAW264.7细胞对PC-3细胞、C4-2细胞作用24h后，N-Cadherin、Vimentin、Icam-1的蛋白表达量明显增加，E-cadherin的蛋白表达量明显减少。
　　结论:
　　1.在肿瘤微环境中，前列腺癌细胞可影响巨噬细胞形态发生改变，并可通过促进AMPK磷酸化蛋白表达，抑制mTor蛋白表达，促进巨噬细胞由M1向M2极化。
　　2.在肿瘤微环境中，极化的M2巨噬细胞(TAM)可促进前列腺癌细胞上皮间质转化过程，从而增加前列腺癌细胞的侵袭与转移能力，加快进展速度。
　　3.TAM与前列腺癌细胞在其微环境中的相互作用对于肿瘤的恶性进展发挥重要的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

综述 肿瘤相关巨噬细胞在增强肿瘤上皮-间质转化和侵袭性的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章