Klotho调控IGF-1R信号通路在非霍奇金淋巴瘤中的作用及机制研究

摘要

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是一组淋巴组织恶性增殖性疾病，也血液系统最常见的恶性肿瘤之一。NHL的发病率及死亡率均位居恶性肿瘤前10位，且发病率以平均每年增加5％的速度增长。世界卫生组织(Worldhealth organization，WHO)将NHL分为不同类型，主要包括B细胞非霍奇金淋巴瘤和T细胞非霍奇金淋巴瘤，少数为NK细胞淋巴瘤。
　　NHL是一种高度异质性的疾病，其在分子病理、诊断、治疗及个体化预后分层等方面的表现均有较大差异。因此，准确的预后分层和规范的个体化治疗是提高NHL疗效的关键。随着生物靶向治疗和细胞免疫治疗的开展，NHL患者的5年生存率已得到明显提高，大部分患者的病情可以得到长期控制，但仍有约30％～40％的NHL患者因初始治疗无效或缓解后早期复发而不能治愈，这部分患者即使接受包括异基因造血干细胞移植等在内的挽救性治疗也很难获得长期生存。临床亟待更加精确的预后分层及更为有效的个体化靶向治疗方案来改善NHL的预后。研究表明，NHL的发生发展与生物分子异常表达及信号通路异常活化密切有关。因此，深入研究NHL发生发展相关的特异性分子标志物及信号转导通路，探讨NHL的发病机制，将为完善NHL的精确预后分层及个体化靶向治疗提供理论基础，进而使NHL获得更高的完全缓解率和长期存活率。
　　Klotho是近来发现的独立的抗衰老基因，可以调节钙磷代谢、抗氧化应激、调节钙离子通道，在衰老及衰老相关疾病中发挥着重要作用。随着近年来对其研究的深入，发现其与人类多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。Klotho的抗肿瘤作用于2008年在乳腺癌中首次被发现。越来越多的研究表明Kloho在宫颈癌、胰腺癌、黑素瘤、胃癌、肝细胞癌等多种实体瘤中表达下调，并可作为疾病预后的独立危险因素。在这些肿瘤中，Klotho通过调控多个信号通路，如胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)信号通路、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）信号通路及Wnt/β-catenin信号通路等，参与肿瘤的发生、侵袭、迁移及耐药，研究表明，NHL中亦存在上述信号通路的异常活化。然而，Klotho在NHL中的作用及相关分子机制目前尚未见报道。
　　本研究以Klotho在NHL中的作用及机制为主要方向，探讨Klotho在NHL中的表达水平，深入研究Klotho在NHL发生发展中的作用及相关作用机制，为NHL的诊断、预后评估及新型生物靶向治疗提供实验基础和理论依据。
　　第一部分 Klotho调控IGF-1R信号通路在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究
　　目的:
　　弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell lymphoma，DLBCL)是成人NHL中最常见的一种亚型，占非霍奇金淋巴瘤所有初治病例种类的40％。DLBCL具有高度侵袭性，在形态学、生物学、遗传学及临床预后方面存在高度异质性。尽管以利妥昔单抗为代表的新型生物靶向治疗及免疫细胞治疗使大多数DLBCL患者的治疗效果显著提高，但仍有约1/3的患者初治耐药或缓解后复发而不能治愈。DLBCL的发生发展是一个多因素参与的复杂过程，尽管目前已做了大量研究，但其病因及发病机制仍不清楚。Klotho在多种癌症中发挥肿瘤抑制因子的作用，可以通过介导多种信号通路的活化调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移，与肿瘤细胞的分化程度、不良预后等密切相关。本研究旨在探讨Klotho在DLBCL中的表达水平，分析其对DLBCL细胞生物学功能的影响，并进一步研究Klotho参与DLBCL发生发展的作用机制。
　　材料与方法:
　　1.病例选择及标本收集;
　　2.免疫组织化学染色;
　　3.细胞培养;
　　4.外周血单个核细胞(PBMCs)的分离;
　　5.CD19+B细胞的分选及纯度检测;
　　6.实时荧光定量聚合酶链式反应;
　　7.蛋白提取及免疫印迹;
　　8.Klotho过表达慢病毒转染DLBCL细胞株;
　　9.CCK-8检测细胞增殖;
　　10.Annexin V-PE/7AAD法检测细胞凋亡;
　　11.酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immune sorbent assay, ELISA)检测血清Klotho蛋白水平;
　　12.DLBCL动物模型体内检测Klotho对DLBCL生长的影响;
　　13.统计学分析。
　　结果:
　　1.免疫组织化学染色结果显示，纳入的50例DLBCL患者标本中，Klotho阳性表达率仅为14％（7/50例），显著低于Klotho在对照组（反应性淋巴结炎）的阳性表达率（80％，16/20例）。对DLBCL患者的临床资料进行统计分析发现，III/IV期DLBCL患者的Klotho表达水平明显低于I/II期DLBCL患者的Klotho表达水平(p=0.002)。Kaplan-Meier生存分析显示，Klotho高表达的患者生存期明显长于Klotho低表达患者的生存期(p＜0.05)。我们检测了DLBCL细胞株(LY1、LY8)中Klotho的mRNA及蛋白表达水平，发现与对照组相比，Klotho的mRNA及蛋白水平均明显降低。
　　2.采用Klotho过表达慢病毒(LV-KL)及阴性对照慢病毒(LV-Con)稳定转染LY1、LY8细胞。与转染LV-Con的细胞相比，转染LV-KL的DLBCL细胞增殖活性明显降低(p＜0.01)，转染LV-Con的细胞增殖活性较未转染组细胞的增殖活性无明显差异。与对照组相比，皮下接种稳定转染LV-KL的LY1细胞的SCID小鼠DLBCL生长的速度及体积明显减低(p＜0.01)。此外，转染LV-KL组小鼠肿瘤组织中Klotho的表达水平较对照组显著增加，Ki67阳性率较对照组明显降低。
　　3.采用流式细胞术通过Annexin V-PE/7AAD染色法检测发现，与转染LV-Con组相比，转染LV-KL可以明显促进LY1细胞凋亡(6.56±0.71％ vs.16.41±2.16％，p＜0.01)及LY8细胞凋亡(7.23±0.65％ vs.16.03±1.85％，p＜0.01)。此外，Klotho过表达可以抑制Mcl-1的表达，促进Cleaved-Caspase-3的表达增加。
　　4.IGF-1对转染LV-KL的LY1、LY8细胞的诱导增殖水平明显低于转染LV-Con组(p＜0.05)。Klotho过表达可显著抑制DLBCL细胞中IGF-1R及下游AKT、ERK1/2的磷酸化。过表达Klotho的DLBCL移植瘤小鼠肿瘤组织中IGF-1R、AKT、ERK1/2的磷酸化水平较对照组显著降低。
　　5.加入外源性Klotho蛋白，即重组Klotho(rhKL)，可以使LY1及LY8细胞的增殖能力明显降低(p＜0.05)。此外，rhKL可以增强LY1及LY8细胞对阿霉素（Adriamycin，ADR）的敏感性。体内实验证实，rhKL处理组DLBCL小鼠的肿瘤体积显著小于空白对照组(p＜0.05)。将小鼠DLBCL肿瘤组织进行免疫组化染色显示，与对照组相比，rhKL处理组小鼠肿瘤组织中Ki67阳性率明显降低。说明rhKL可以在体内发挥抑制DLBCL生长的作用。ELISA法检测30例初治DLBCL患者及15例健康志愿者（对照组）血清分泌型Klotho蛋白浓度显示，DLBCL患者中分泌型Klotho浓度明显低于对照组(p＜0.05)。
　　结论:
　　上述研究证实，Klotho在DLBCL组织及多种细胞株中表达显著下调。Klotho的表达水平与DLBCL患者的临床分期、预后明显相关。慢病毒介导Klotho过表达可以在体外、体内抑制DLBCL细胞的增殖活性，Klotho高表达可以降低DLBCL肿瘤组织中Ki67的阳性率。Klotho过表达可以诱导DLBCL细胞凋亡、调控凋亡相关蛋白的表达。Klotho过表达可以抑制DLBCL中IGF-R及其下游靶分子AKT、ERK1/2的磷酸化，抑制IGF-1R信号通路的活化。外源性Klotho蛋白可以作为活性形式在体外、体内发挥抑制DLBCL细胞生长的作用。本研究结果将为DLBCL的发病机制研究、精确预后评估及特异性靶向治疗提供新的理论依据。
　　关键词:弥漫大B细胞淋巴瘤;Klotho; IGF-1R;靶向治疗
　　第二部分 Klotho在T细胞淋巴瘤中的生物学作用及机制研究
　　目的:
　　T细胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)是来源于T淋巴细胞的一种恶性克隆增殖性疾病，其发病地域差异较大，在我国较欧美国家常见。T细胞淋巴瘤具有高度侵袭性，目前尚缺乏确切的随机多中心的化疗及移植相关的临床研究结果，大部分患者对化疗敏感性低，最终难治、复发，预后明显差于B细胞淋巴瘤。研究证实抗衰老基因Klotho可以通过调控IGF-1R信号通路抑制多种肿瘤细胞的生长。然而Klotho在T细胞淋巴瘤发生发展中的作用尚不明确。本研究旨在探讨Klotho在T细胞淋巴瘤中的表达水平及对T细胞淋巴瘤细胞生物学行为的影Ⅱ向，进一步研究Klotho在T细胞淋巴瘤中发挥作用的相关机制。
　　材料与方法:
　　1.病例选择与标本收集;
　　2.免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）;
　　3.细胞培养;
　　4.外周血单个核细胞的分离;
　　5.实时荧光定量聚合酶链式反应;
　　6.蛋白提取及免疫印迹;
　　7.Klotho过表达慢病毒载体转染T细胞淋巴瘤细胞;
　　8.CCK-8检测细胞增殖;
　　9.Annexin V-PE/7AAD法检测细胞凋亡;
　　10.细胞免疫荧光;
　　11.统计学分析。
　　结果:
　　1.免疫组织化学染色法检测Klotho蛋白在35例初诊T细胞淋巴瘤患者组织石蜡切片中的表达水平，同时使用20例反应性增生的淋巴结组织作为对照。在反应性增生的淋巴结组织中，Klotho的阳性表达率为75％(15/20)，而在T细胞淋巴瘤组织中Klotho阳性表达率仅为14.3％(5/35)。T细胞淋巴瘤细胞株中Klotho的mRNA表达水平及蛋白表达水平均较正常对照细胞减低。
　　2.采用Klotho过表达慢病毒及阴性对照病毒稳定转染T细胞淋巴瘤细胞株后，RT-PCR证实转染LV-KL组细胞Klotho的mRNA表达水平显著高于对照组(p＜0.01)。与未转染组相比，转染LV-KL组的细胞增殖水平显著降低(p＜0.05)，转染LV-Con组细胞的增殖水平较未转染组无明显变化。
　　3.通过流式细胞术检测发现，在T细胞淋巴瘤细胞株（Jurkat、Karpas299）中，转染LV-KL组细胞的凋亡率明显高于转染LV-Con组(p＜0.05)。与对照组相比，转染LV-KL组T细胞淋巴瘤细胞中Mcl-1及Pro-Caspase-3蛋白表达水平显著降低。
　　4.IGF-1处理可以增强T细胞淋巴瘤细胞的增殖活性，但是对转染LV-KL的T细胞淋巴瘤细胞增殖活性的诱导作用低于转染LV-Con组。在转染LV-KL的T细胞淋巴瘤细胞株中，IGF-1R及其下游AKT、ERK1/2的磷酸化水平均明显下降。
　　结论:
　　上述研究证实，Klotho在T细胞淋巴瘤组织及多种T细胞淋巴瘤细胞株中表达降低。过表达Klotho可以抑制T细胞淋巴瘤细胞的增殖活性，诱导T细胞淋巴瘤细胞的凋亡，并调控T细胞淋巴瘤细胞中凋亡相关蛋白Mcl-1、Pro-Caspase-3的表达。Klotho可以抑制T细胞淋巴瘤中IGF-1R信号通路的活化。提示Klotho有望作为T细胞淋巴瘤的新的生物标志物及治疗靶点，为提高T细胞淋巴瘤的疗效提供新的治疗策略。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 Klotho调控IGF-1R信号通路在弥漫大B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第二部分 Klotho在T细胞淋巴瘤中的生物学作用及机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

English Review Klotho：a novel biomarker for cancer

致谢

攻读学位期间发表学术论文及参加学术交流

学位论文评阅及答辩情况表

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