营养性肥胖合并脂代谢异常对雄性大鼠生殖功能的影响及其机制

摘要

背景:
　　众所周知，营养性肥胖和高脂血症作为代谢综合征的重要表现，严重影响着人健康，已成为全世界公共健康关注的焦点。营养性肥胖容易发生内脏性肥胖，导致脂代谢紊乱，而高脂血症也通常同时伴有肥胖的发生，二者往往相互伴随，密不可分。脂代谢紊乱和肥胖都与不健康的生活方式和饮食结构密切相关，进食过高热量容易发生代谢紊乱，均能够引起复杂的新陈代谢、分泌和血液动力学变化，是发生动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的重要危险因素，导致多种不良后果发生。而且近年来二者对于生殖系统的影响备受关注。生殖异常是肥胖和脂代谢紊乱个体中常见的现象。既往研究过多着重于肥胖和高脂血症对于女性生殖系统的影响，如导致月经不规律、不孕不育、与胰岛素抵抗相伴随的多囊卵巢综合征等，近来对于男性生殖系统的影响研究逐渐成为热点，越来越受到医学界和社会的重视。事实上，一直的观点认为肥胖男性患者的睾酮浓度降低，而当体重减轻时则睾酮浓度升高。同样地，与非肥胖个体相比，促黄体激素(LH)释放在肥胖病人中显著降低。
　　正常细胞的凋亡是机体组织清除损坏或者衰老等类型细胞的方式。从胚胎发生开始，到接下来的机体生长发育过程，细胞凋亡都发挥着不可替代的功能。遗传信息的正确传递依赖于睾丸生殖细胞的正常凋亡，凋亡有利于及时清除畸形的或者结构不完整的有缺陷的细胞，并且支持细胞的转运是生精细胞得到营养的主要来源，如果没有凋亡，支持细胞数量有限，无法给予生精细胞提供充足的支持和营养，使得生精细胞数量虽多，但质量下降，导致生殖功能紊乱。相反地，过多凋亡也会因为生精细胞数量减少从而导致生殖功能障碍。而在细胞凋亡机制中，线粒体凋亡的因素尤其重要。凋亡发生时，线粒体发挥重要的作用，线粒体膜通透性增加，细胞一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)生成增多，NOS是催化成为NO的重要酶，可以以多种形式在睾丸组织中表达，如神经型、内皮型等，许多重金属、非电离辐射等理化因素可通过对NOS活性的影响从而引起NO的变化，而NO在雄性生殖系统中发挥着重要的作用。线粒体凋亡中就会因NOS的变化从而使得三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate， ATP)酶活性显著降低，从而胞浆中膜间蛋白细胞色素C(Cyt c)含量增加，进一步激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）等凋亡相关因子，引起凋亡的发生。肥胖及脂代谢异常所导致的生殖功能低下与诸多因素相关，细胞凋亡便是其中之一。
　　男性生殖功能障碍还通常由于雄激素减少所引起。睾酮和双氢睾酮均是体内重要的雄激素，双氢睾酮生物活性更大，睾酮在富含5-α还原酶的性腺器官，如前列腺、附睾等可还原为有着更强雄激素作用的双氢睾酮。睾酮有着生殖生理功能和非生殖生理功能两方面重要作用。生殖生理功能方面，睾酮有维持男子性功能和副性特征、维持雄性攻击意识的作用。非生殖生理功能方面，睾酮有促进三大物质如糖、脂肪、蛋白质代谢及核酸合成的作用，还有着影响肝脏诸多血浆蛋白质的合成、分泌，刺激肾脏组织促红细胞生成素分泌、触发造血干细胞分化为原红细胞的作用，另外还能刺激组织摄取氨基酸，还是很强的生长刺激激素，能通过刺激骨细胞增殖，加速血管及周围间质细胞增生及钙盐沉积，从而促进骨骼和肌纤维生长，而且对于心血管系统、呼吸系统、神经系统的分化都有着显著作用。对于男性生育能力的评价除了配偶妊娠外还包括对于睾酮、黄体生成素等激素水平的检测。常见的生殖功能障碍的表现多为性欲减退，勃起障碍，从而导致生殖能力下降。既往研究表明肥胖和脂质代谢紊乱均可导致男性减少睾酮的合成和增殖。
　　睾酮的合成和增殖也受诸多因素的影响。StAR、P450scc是睾酮生成过程中重要的两个限速酶，在睾酮合成过程中发挥着重要的作用。另外促黄体生成素(LH)可直接作用于间质细胞膜上的促黄体生成素受体(LHR)，启动并调节睾酮的合成。细胞信号转导的主要途径——AC-cAMP-PKA途径在其中发挥了重要的作用。当促性腺激素与细胞膜上相关受体结合后能通过激活腺苷酸环化酶(AC)活性，从而将细胞内cAMP水平上调，将细胞外信号转换为细胞内信号。而cAMP作为第二信使，催化并激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，从而调节睾酮合成相关基因的表达。这其中任何一个环节受损都会影响到睾酮的合成，从而影响生殖功能。
　　综上，正常生殖功能的维持需要激素的分泌、生精细胞的质量、数量得以保证发挥正常功能以及下丘脑垂体性腺轴的综合调控等多方面的作用，而且这些因素相互影响，共同作用，有的存在正负反馈效应，起着协调功能，每个因素缺一不可。随着近年来对于脂代谢紊乱和肥胖对于生殖功能的影响研究增多及精准医疗概念的推广，对于疾病发病机制的研究更为深入。而导致雄性生殖功能低下及不育也有内分泌、遗传及性交功能异常等多方面的病因，本文拟从生精细胞凋亡及内分泌相关激素角度，依靠分子生物学、生物化学等方法，通过建立高热量诱导的营养性肥胖脂代谢异常雄性大鼠模型，检测血脂相关生化指标的变化，并检测与细胞凋亡有关的Cyt c、caspase-3基因mRNA和蛋白表达，以及检测血清和睾丸中睾酮含量，观察睾丸组织形态学改变，选取睾酮合成关键酶基因信号通路为研究靶点，检测StAR、P450scc及AC-cAMP-PKA通路相关基因和蛋白的表达差异。通过分析在大鼠睾丸间质细胞中对于睾酮的合成和增殖起关键作用的上述不同蛋白质的表达，初步探讨肥胖合并高脂影响生殖功能的可能机制，以研究其对于雄性生殖系统的危害。本文研究着重从发病机制和病因探究肥胖合并脂代谢异常导致的生殖功能减弱，可为临床工作提供理论铺垫，为后期治疗脂代谢紊乱导致的男性生殖功能低下相关疾病提供了指导方向。
　　研究方法:
　　7周龄健康雄性SD大鼠共30只，每组15只随机分配，分别为高热量高脂饮食组和正常饮食对照组。高脂组给予特别配制的高脂、高热量饲料喂养，对照组给予普通饲料喂养。两组大鼠于实验开始第0天和16周后，分别测量体长(cm)，计算Lee's指数[Lee's指数=体重(g)1/3×103/体长(cm)]，期间每周称量大鼠体重一次并记录;外周血中的胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)采用全自动生化分析仪(ACA)进行检测;第16周末处死大鼠取睾丸并称取附睾周围脂肪块重量，并立即取睾丸并保存标本。RT-PCR主要用来验证两组大鼠睾丸组织中Cyt c、caspase-3基因mRNA的不同，免疫组织化学方法用来检测Cyt c、caspase-3蛋白的表达;对于睾丸组织形态的微观变化采用HE染色法观察，使用TUNEL方法主要比较两组大鼠细胞凋亡的差异。同时检测大鼠血清性激素，并观察睾丸组织形态学等指标，分别提取大鼠睾丸组织中的RNA和总蛋白，运用半定量RT-PCR法和Western blot法检测睾酮合成中StAR、P450scc等基因和蛋白的表达差异，并采用ELISA方法检测腺苷酸环化酶(AC)活性和环磷酸腺苷(cAMP)含量。
　　结果:
　　1.大鼠体重、体长、Lee's Index、附睾周围脂肪重量(EAM)及脂代谢相关指标的观察高脂饲养组和对照组大鼠体重、体长及Lee's指数在喂养第0周无显著性差异。喂养第16周末，高脂饲养组相比对照组鼠体重增长较快，Lee's指数及附睾周围脂肪块重量明显高于16周末对照组。与对照组相比，高脂饲料喂养组SD大鼠外周血TC、TG水平明显升高，HDL-C水平明显下降(p＜0.05)。
　　2.大鼠睾丸组织病理观察
　　HE染色发现:正常对照组大鼠的精原、精母及精子细胞均外形完整，无明显破坏，三种生精细胞的染色质形状分别为圆粒状、团块状及致密均匀状。而肥胖高脂组则发现生精上皮残缺不完整，结构疏松、间隙增大，原有的正常连接缺如，可见精母细胞脱落坏死，而且大鼠睾丸生精小管出现萎缩，间质增加，小管内精子发生阻滞。
　　以上结果表明肥胖合并高脂可导致生殖细胞超微结构形态发生变化。
　　3.大鼠睾丸组织凋亡细胞的观察
　　在16周末，对照组大鼠睾丸组织中细胞凋亡数目较少，尤其是精子及精子细胞极少见，仅出现分散的以精母和精原细胞的凋亡。而肥胖高脂组生精细胞凋亡指数较对照组显著升高(P＜0.05)。
　　以上结果表明肥胖合并高脂状态可显著增加生精细胞的凋亡。
　　4.大鼠睾丸组织中Cyt c和Caspase-3 mRNA和蛋白表达情况
　　RT-PCR以及免疫组织化学结果显示:caspase-3 mRNA和蛋白表达在肥胖高脂组中可见明显增加，同样肥胖合并高脂组大鼠睾丸中Cyt c mRNA、蛋白表达也较正常对照组明显增加。
　　以上结果表明在肥胖高脂状态下Cyt c和Caspase-3 mRNA和蛋白表达明显增加，而二者为线粒体凋亡过程中重要因子，故而推论肥胖合并高脂可能通过线粒体途径导致生精细胞的凋亡。
　　5.大鼠性激素水平和睾丸形态学
　　肥胖高脂组与对照组相比，血清睾酮、SHBG、LH和IGF-1水平显著降低，且睾丸中合成睾酮也明显减少。睾丸组织中曲细精管细胞层数较对照组减少，生精细胞中有诸多脂滴堆积，细胞与细胞之间空隙增大变宽，还可见无功能的空泡样改变。
　　以上结果表明高脂可通过影响与睾酮合成相关激素以及性腺器官的微观结构从而影响雄性生殖系统。
　　6.肥胖合并脂代谢异常导致雄性生殖损伤的机制探讨
　　肥胖合并脂代谢紊乱可导致StAR、P450scc蛋白表达水平下降，可显著降低AC活性和cAMP含量，而对LHR mRNA和蛋白的表达水平无明显影响，提示肥胖合并脂代谢紊乱是通过降低血清中LH的水平，减少LH与LHR的结合，进而影响AC-cAMP-PKA途径，最终导致睾酮合成酶基因转录和表达水平降低。
　　结论:
　　1.营养性肥胖合并脂代谢异常导致了生精细胞凋亡的明显增多并可以引起生殖细胞微观结构的变化。
　　2.肥胖合并脂代谢紊乱出现睾丸笙殖细胞大量凋亡，其可能的机制是通过线粒途径中两个重要的因子Cytc和caspase-3调控睾丸生殖细胞凋亡。
　　3.肥胖合并高脂血症可导致血清中LH水平下降，减少LH与LHR的结合，进而抑制AC-cAMP-PKA通路，影响睾酮合成限速酶基因(StAR、P450scc)的转录表达。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一章 营养性肥胖合并脂代谢异常对雄性大鼠生殖细胞凋亡的影响

材料与方法

结果

讨论

第二章 营养性肥胖合并脂代谢异常对雄性大鼠生殖损伤的机制

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读博士期间发表的学术论文目录

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