TLR4/ROS/miRNA-21途径在脂多糖促进肺癌进展中的研究

摘要

目的:
　　LPS（Lipopolysaccharide，脂多糖）是革兰氏阴性杆菌外膜的主要成分之一，能够直接促进肿瘤进展。TLR4能够识别革兰氏阴性杆菌的LPS，TLR4表达增强预示肺癌病人病情进展。这些发现表明通过LPS活化TLR4对肺癌进展至关重要。然而，肺癌进展是否与LPS直接相关及其相关机制尚不明确。
　　MiRs（MicroRNAs，寡核糖核酸）是非编码小RNA分子，是重要的mRNA和蛋白表达的调节者，在癌症进展中充当了重要而又复杂的角色。MiRs与多种恶性肿瘤的发生进展密切相关。MiR-21是MiRs一种，是在实体瘤中最常见表达的寡核糖核酸，其在恶性肿瘤组织中表达量与正常组织相比高5～100倍。
　　在这些研究中，描述了LPS在肺癌肿瘤细胞生长过程中的作用，评估了MiR-21在其过程中的意义。证实在肺癌肿瘤细胞生长过程中MiR-21是必须的。肺癌肿瘤细胞中LPS活化TLR4后，会引起ROS产生增多，ROS反过来又会引起miR-21表达上调。这些研究可进一步理解肺癌的发病机制，并对肺癌的治疗提出新的治疗措施。
　　方法:
　　道德规范声明
　　所有病人通过邮件形式参与研究。临床样本研究遵从1964年《赫尔辛基宣言》及其修订版。动物实验按照医学动物实验手册执行。人和动物实验也同时也遵从同济机构(Institutiongal)伦理委员会。
　　病人
　　全部50名肺癌病人转染革兰氏阴性杆菌入组研究。肺癌均为病理诊断。样本中有自身免疫疾病或经过免疫治疗的排除在外。
　　鼠
　　从上海动物实验中心购买6-8周雌性BALB/c裸鼠，所有小鼠均在无病原体条件下饲养。
　　细胞培养和试剂
　　人肺癌细胞取自组织标本。将组织标本放置于50mL的离心管内，离心管内加入5～10mLⅠ型胶原酶溶液(Invitrogen)(在LHC培养基中溶解胶原酶Ⅰ，最终浓度为1mg/mL)。在37℃水浴箱中温浴、振荡1小时。将含青/链霉素、10％胎牛血清(fet bovine serum，FBS)的LHC培养基混匀细胞接种至24孔培养板中，放入35％CO、2℃、饱和湿度培养箱中，每2～3天观察细胞生长状态，并半量换液。LPS购自Sigma，psiRNA载体及对比剂购自Origene，Mir-21(MI0000077)表达载体及对比剂购自Origene，人miR-21shRNA(shADV-215486)及对比剂购自Vector Biolabs，Tempol购自Santa Cruz。所有试剂均规范使用。
　　体外肿瘤生长
　　利用MTT比色法分析原代人肺癌细胞扩增表达观察体外肿瘤生长。将96孔培养板每孔中接种4×103个肺癌细胞，加入或不加入LPS(0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)，培养3天，每天观察肿瘤生长。用MTT比色法分析细胞扩增。
　　体内肿瘤生长
　　裸鼠内原代肺癌细胞生长监测如前所述。将4×106个原代肺癌细胞悬浮于200ulPBS中，将其注射于裸鼠的皮下。相同剂量的PBS注入对照组小鼠。在皮下注射前，用LPS(10ug/ml)处理原代肺癌细胞24小时，或用PBS作为参照。用数显卡尺测量移植后3、6、9天后的肿瘤体积。每个肿瘤均被不同人员测量两次。
　　R-T PCR检测
　　利用QiagenRNeasy mini kit提取总的RNA，利用Maxima First Strand cDNA Synthesisb Kits（Thermo Scientific公司）转录合成cDNA，引物购自Applied Biosystems公司，利用Maxima SYBR Green qPCR Master MIXES（美国Thermo）的试剂定量PCR分析进行重复检测mRNA的表达，GAPDH作为内对照。TaqMan miRNA assays（Applied Biosystems公司）监测miRNA表达，U6RNA作为内参照。
　　流式细胞仪检测
　　流量分析，PE共轭抗体人抗TLR4抗体0.5×106个细胞染色(12-9917-42，eBioscience公司)，或同型对照（12-4724-81，eBioscience公司），流式细胞仪分析。用CellROX Deep Red Reagent（Life Technologies公司）检测ROS水平。FlowJo软件分析统计数据。
　　结果:
　　1.LPS促进肺癌进展
　　为研究LPS在肺癌肿瘤细胞生长过程中的作用，用不同剂量的LPS(0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)刺激肺癌细胞，观察细胞的生长。结果显示肺癌细胞的生长与LPS存在剂量依赖性。在肺癌细胞中能快速发现TLR4。TLR4被LPS刺激后，表达明显上调，与剂量呈正相关。为研究TLR4、LPS在肺癌细胞生长中的作用，将肺癌原代细胞转染上TLR4shRNA，然后给予LPS刺激调控。发现转染上TLR4shRNA的肺癌细胞，TLR4在mRNA和蛋白水平上的表达均降低，并阻碍脂多糖诱导肺癌原代细胞的生长。这些数据表明TLR4是LPS诱导的肿瘤细胞生长的关键受体。
　　为确定在活体上LPS促肺癌细胞生长过程中的作用，将肺癌细胞注入小鼠体内。发现有LPS刺激的肺癌细胞生长速度明显高于无LPS刺激的肺癌细胞。阻断TLR4后，就减缓了肺癌细胞生长。
　　实质上，这些结果表明通过LPS激发TLR4后可促进肺癌细胞生长。
　　2.LPS促进肺癌细胞生长中需要MiR-21
　　为评估MiR-21在LPS促进肺癌细胞生长中的作用，观察MiR-21在肺癌细胞中的表达。发现MiR-21与LPS存在剂量依赖性。LPS促进肺癌细胞生长过程中，阻断TLR4后，MiR-21的表达同样也出现抑制。当肺癌细胞转染miR-21shRNA后，LPS激活肺癌细胞，发现转染miR-21shRNA的肺癌细胞表达降低，并阻断了LPS诱导的肿瘤生长。
　　为研究miR-21在LPS促进肺癌细胞体内生长过程中的潜在作用，将转染miR-21shRNA和预处理LPS的肺癌细胞种植于裸鼠体内，结果显示下调miR-21表达会减弱LPS增强肺癌细胞增长。这些结果表明LPS促进肺癌细胞增长是需要miR-21强化的。
　　3.MiR-21促进肺癌细胞生长
　　假定MiR-21在LPS诱导肿瘤生长中的重要作用，发现了miR-21自身促肺癌细胞生长的功能。转染miR-21的肺癌细胞导致miR-21表达上调和肿瘤生长。转染miR-21shRNA缓解肺癌细胞生长。为证实在体内的研究结果，将转染miR-21及miR-21shRNA的肺癌细胞分别植入裸鼠内，发现在体内增加miR-21表达增强肿瘤生长，降低miR-21表达会减弱肿瘤生长。这些发现认为miR-21是肺癌肿瘤生长的必须致癌miRNA。
　　众所周知m iR-21作用于磷酸酶基因(PTEN)和程序性细胞死亡因子(PDCD4)，但是否在肺癌细胞中miR-21亦作用于PTEN和(PDCD4)。转染miR-21的表达降低了PTEN和PDCD4的表达。反之亦然，转染miR-21shRNA使PTEN和PDCD4的表达上调。更重要的是，PTEN和PDCD4的过度表达会阻断肺癌细胞生长中miR-21的致癌作用。这些数据表明在肺癌中PTEN和PDCD4是miR-21主要作用目标。
　　4.LPS引起miR-21表达，引起细胞内ROS产生增加
　　活性氧(ROS)参与TLR4激发的免疫应答和肺癌进展。发现肺癌细胞内ROS水平与LPS浓度呈正相关，LPS浓度愈高，ROS水平亦愈高。结果表明在肺癌细胞中LPS促进ROS的产生。阻断TLR4后则阻断LPS诱导ROS的产生。为研究LPS诱导肺癌生长中ROS的作用，将LPS处理的肺癌细胞，再用Tempol（4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶）消除ROS。结果显示，Tempol阻断了LPS诱导肺癌生长。发现LPS诱导miR-21表达需要ROS，并发现Tempol阻断miR-21与LPS正相关性。
　　为研究在体内LPS诱导肺癌细胞生长中ROS的作用，将含或无Tempol的LPS预处理的肺癌细胞注入裸鼠内，结果显示在体内有Tempol的肺癌细胞抑制了LPS诱导的肿瘤生长。
　　总之，ROS产生增加是LPS诱导miR-21表达和肿瘤生长是至关重要的。
　　5.在肺癌病人中TLR4表达与miR-21表达和ROS产生具有相关性
　　为证实在临床上这些研究结果，分析了肿瘤组织和正常组织中TLR4和miR-21的表达。结果显示TLR4和miR-21的表达在肿瘤组织中明显增高。进一步分析，未接受治疗的肺癌细胞TLR4、miR-21的表达和ROS水平。分析发现TLR4表达与miR-21表达和ROS水平存在相关性。在肺癌细胞中ROS水平与miR-21表达具有正相关性。
　　这些结果表明在肺癌病人肿瘤进展中存在TLR4/ROS/miR-21通路。
　　结论:
　　在肺癌细胞中，LPS活化TLR4后导致ROS产生增加，又增加miR-21的表达和肿瘤增长。TLR4表达与miR-21表达和ROS水平存在紧密相关性，表明未治疗的肺癌细胞存在TLR4/ROS/miR-21通路。这些结果揭示了个新的机制:革兰氏阴性杆菌能加速肺癌进展，并为治疗肺癌病人提供新的有效治疗措施。

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结论

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