人抗原R与转化生长因子β1之间的反馈调节对哮喘气道重塑发生发展的作用

摘要

研究背景
　　目前全球患有哮喘人数超过3亿，其患病率与死亡率猛速增加，寻求有效的治疗手段刻不容缓，而最根本的治疗突破点离不开机制的探索。慢性炎症和气道高反应是哮喘发病的主要机理，近年来关于气道重塑及控制气道重塑的药物研发迎来了高峰。
　　人抗原R(Human antigen R，HuR)是一种RNA结合蛋白，主要通过与目的基因的3'UTR结合发挥功能，包括COX-2、CyclinD、VEGF、p53等。研究HuR与TGF-β1对哮喘气道重塑发生发展的机制是本课题的核心，旨在为哮喘控制方面提供新的方向。
　　在本研究中，Western印记、PCR、免疫荧光等发现在PDGF刺激下，气道平滑肌细胞HuR、TGF-β1、α-SMA和COI-Ⅰ表达呈时间依赖性。利用RNA干扰技术阻断HuR表达后，TGF-β1、α-SMA和COM表达降低。然而，利用RNA干扰技术降低TGF-β1表达，HuR、COM表达也明显降低，并且额外增加TGF-β1刺激，HuR和COM表达可部分恢复。综合以上分析，我们猜测在气道平滑肌细胞内可能存在HuR/TGF-β1的反馈调节，且此反馈调节对哮喘状态下气道重塑的发生发展有影响。分别用OVA和PBS刺激BALB/c小鼠以构建哮喘小鼠和对照。研究发现，OVA诱导的哮喘小鼠，HE染色发现小鼠肺实质及气道周围大量炎症细胞的聚集，Western印记、RT-PCR及免疫组织化学技术均证实在OVA诱导的哮喘小鼠，肺组织内高表达HuR、TGF-β1，从而在小鼠体内证实了HuR、TGF-β1对气道重塑的作用。
　　目的
　　1.采用Western印记、RT-PCR、免疫组织化学等检测气道平滑肌细胞内HuR、TGF-β1等的表达。
　　2.siRNA干扰HuR，检测ASM形态学及功能学改变。此外，利用特异siRNA干扰TGF-β1表达或者增加外源性TGF-β1刺激ASM，检测HuR、α-SMA和胶原酶Ⅰ的表达，探讨HuR及TGF-β1对气道重塑的作用。
　　3.探讨哮喘小鼠体内HuR与TGF-β1对气道重塑的作用。
　　方法
　　1.PDGF(20μg/L)分别刺激气道平滑肌细胞0、6、12和24 h。分别检测各时间点细胞内相关指标RNA水平及蛋白表达水平。RNA干扰技术分别阻断HuR、TGF-β1表达，Western印迹检测干扰效率，探讨HuR与TGF-β1之间的作用。
　　2.为探讨哮喘小鼠气道重塑发生与HuR/TGF反馈调节的作用，BALB/c小鼠分别用卵蛋白(OVA)和PBS致敏，收集肺泡灌洗液检测炎性细胞。切取小鼠肺组织采用Western印记、RT-PCR和免疫组织化学检测HuR、TGF-β1、α-SMA和胶原酶Ⅰ的表达。
　　结果
　　1.PDGF分别在0、6、12和24h刺激培养的气道平滑肌细胞，与0h相比，细胞内TGF-β1 RNA水平分别增加了27％，60％和87％(P＜0.05)，蛋白表达分别增加了31％，69％和106％(P＜0.05)，α-SMA和胶原酶Ⅰ表达也随时间依递增。表明哮喘状态下TGF-β1、α-SMA和胶原酶Ⅰ呈时间依赖性表达。
　　2.干扰HuR表达，干扰组细胞凋亡率(3.35％)较对照组(1.236％)增加(P＜0.05)，HuR可能参与调控ASM形态学改变。干扰组细胞内及细胞上清中TGF-β1、α-SMA和胶原酶Ⅰ表达较对照组显著降低(P＜0.05)。进一步给予平滑肌细胞actinomycinD刺激，发现干扰组TGF-β1 mRNA稳定性较对照组明显降低(P＜0.05)。因此我们推测HuR主要通过增加TGF-β1 mRNA稳定性从而调控TGF-β1表达并进而影响α-SMA和胶原酶Ⅰ的表达。
　　3.siRNA干扰TGF-β1后,CCK8检测发现干扰组细胞增殖明显降低，细胞内 TGF-β1表达较对照组也降低了23.8％，然而增加外源性TGF-β1(4ng/ml)刺激，HuR和COI-Ⅰ表达恢复，说明TGF-β1参与调控HuR与COI-Ⅰ的表达。
　　4.OVA组小鼠肺组织内炎性反应较PBS组更显著，OVA组诱导的小鼠BALF内细胞总数7.56±1.53×106/ml，其他细胞如Macrophages、Eosnophils、Lymphocytes及Neutrophils所占比例依次:28.20±1.95％，35.40±2.02％，26.70±2.38％和7.08±0.74％，PBS刺激组小鼠BALF内细胞总数3.69±0.98×106/ml，相应细胞所占的比例依次:68.88±2.73％，6.25±0.95％，18.12±1.58％和3.02±0.63％（P＜0.05）。Sirius Red Staining发现OVA组小鼠肺间质内弥漫Ⅰ型和Ⅲ型胶原沉积。
　　5.PCR、Western印记联合免疫组织化学共同显示OVA组小鼠肺组织内高表达HuR、TGF-β1等，在小鼠进一步证实了HuR与TGF-β1对气道重塑的作用。
　　结论
　　1.HuR与TGF-β1共同调控α-SMA和COI-Ⅰ的表达，从而影响气道重塑。
　　2.HuR、TGF-β1和α-SMA在哮喘小鼠肺组织内高表达，肺间质内存在大量Ⅰ型和型胶原沉积。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

骨化性气管支气管病2例并文献复习

致谢

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