二甲双胍上调βKlotho抑制雄激素相关的前列腺癌上皮间质转化

摘要

研究背景：
　　世界范围内，前列腺癌在男性所有恶性肿瘤中发病率位居第二，在美国的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤，在我国其发病率也呈逐年上升的趋势。早期患者可通过根治性手术或者根治性放疗治愈。对于晚期前列腺癌，雄激素剥夺(androgen deprivation therapy, ADT)仍然是主要的治疗方法。虽然初始治疗阶段ADT能有效抑制肿瘤生长，但是在2-3年内超过一半的患者会发展到耐药阶段，也就是我们通常所知的去势抵抗性前列腺癌(castration-resistantprostate cancer，CRPC)，并且其中位生存期仅为12～18个月。雄激素受体(androgen receptor，AR)信号通路的持续激活仍然是CRPC发生、进展的关键因素。
　　近年来有研究表明，上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)和AR信号通路存在着广泛的串话，在前列腺癌发生以及进展为CRPC的过程中发挥着重要作用。虽然EMT和AR信号通路之间有着密切的联系，但具体到调控机制，不同的研究者得出了不同甚至是矛盾的结论，仍需要进一步的实验加以验证。除AR信号通路外，其它一些信号通路也参与到前列腺癌EMT过程中，包括:RTK、Pten、STAT3、Wnt和Notch-hedgehog等。通过干扰上述信号通路，靶向逆转EMT可能为以后前列腺癌的治疗提供新的思路。
　　成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）及其受体FGFR普遍存在于正常细胞中，共同构成FGF信号通路，在细胞生长、分化、迁移、血管生成以及组织创伤修复中起重要作用。近年研究表明，该通路在前列腺癌的发生、发展中同样发挥重要作用。其作用机制主要是通过激活一系列下游信号通路实现，包括Ras-Raf-Mapk、PI3k-Akt、Stats和PLCγ等。大部分FGFs是通过自分泌或者旁分泌的方式发挥生理作用。FGF19亚科是FGFs家族中特殊的一类，包括FGF19、FGF21、FGF23，它们可通过类似激素的内分泌功能入血从而调节许多生理功能，包括能量和胆汁酸的代谢，糖脂的代谢，以及维持磷、维生素D的动态平衡。有学者先后报道了FGF19、FGF23能够促进前列腺癌的进展。另有研究提示FGFR1的活化可以导致不可逆的前列腺腺癌和上皮间质转化，促进前列腺癌的进展。尽管大量研究把FGF/FGFR信号通路的激活和肿瘤的进展联系起来，但是在一些特定的条件下，此通路的激活可以表现出抑制肿瘤的作用。此外，一系列的FGFs和FGFRs抑制剂已经应用在了前列腺癌的基础和临床试验中，展现出其广阔的应用前景。
　　FGF/FGFR信号通路的激活需要一个关键分子:βklotho(KLB)。βklotho作为FGF19、FGF21的共受体，可以提高FGF19、FGF21与FGFRs（特别是FGFR1和FGFR4）的亲和性，形成βklotho-FGF19/FGF21-FGFR4复合体，发挥调节血糖、胆汁酸、能量代谢的生理作用。βklotho目前在肿瘤中的研究较少，并且其到底是发挥促癌还是抑癌作用仍存在争议。虽然FGF19/FGFR4信号通路能够促进前列腺癌的进展，但是作为FGF19/FGFR4共受体，βklotho在前列腺癌的表达以及βklotho与前列腺生物学行为的关系还未有报道。
　　二甲双胍是世界范围内治疗2型糖尿病应用最广泛的药物。流行病学研究表明，二甲双胍可以降低多种肿瘤的发病率和疾病进展率。目前已有大量体内、体外研究表明二甲双胍具有广泛的抗肿瘤作用，主要和激活AMPK(AMP-activatedprotein kinase)通路和增加胰岛素敏感性有关。有研究表明AMPK和AR之间存在负反馈调节，二甲双胍可下调AR表达，抑制前列腺癌的生长。除此之外，二甲双胍在多种肿瘤（包括前列腺癌）的研究中表现出了抗EMT的作用。虽然目前已有大量的二甲双胍抑制肿瘤发生、进展的研究，但是近年的研究热度仍然不减，二甲双胍抗肿瘤的新机制层出不穷。研究表明βKlotho与FGF19-FGFRs形成复合体，具有和二甲双胍类似的降血糖作用，二甲双胍和βKlotho之间是否具有潜在联系，目前还未见报道。
　　第一部分:βKlotho抑制雄激素相关的前列腺癌上皮间质转化
　　目的：
　　首先研究雄激素/雄激素受体信号通路与前列腺癌EMT的关系，检测βklotho的表达水平与前列腺癌患者临床参数以及预后的关系，进而在体内、体外实验中探讨βklotho与前列腺癌EMT的关系，从而发现逆转EMT的潜在靶点。
　　方法：
　　1.采用Western Blot检测双氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)对于AR阴性细胞系PC3和AR阳性细胞系LNCaP EMT的影响。
　　2.采用Western Blot检测βKlotho在不同前列腺癌细胞系中的表达，免疫组织化学检测βKlotho在前列腺增生和前列腺癌组织中的表达。The Human ProteinAltas数据库分析βKlotho在正常前列腺组织和前列腺癌中的表达。
　　3.采用卡方检验检测βKlotho表达水平与前列腺癌患者年龄、肿瘤分期、分级的相关性;通过Kaplan-Meier单因素生存分析法检测肿瘤分期、分级、βKlotho表达水平与生存预后的关系。
　　4.采用CCK-8、克隆形成实验检测βKlotho对于前列腺癌细胞系增殖的影响;采用Transwell、细胞划痕实验检测βKlotho对于细胞迁移、侵袭能力的影响;通过流式细胞仪检测Annexin V-PE/7-AAD染色情况评估细胞的早期凋亡。
　　5.采用Western Blot、细胞免疫荧光法检测过表达和敲减βKlotho对前列腺癌细胞EMT的影响。
　　6.裸鼠成瘤实验检测βKlotho对于前列腺肿瘤生长的影响，免疫组织化学检测βKlotho对于裸鼠前列腺癌EMT的影响。
　　结果：
　　1.DHT能够显著下调AR阴性的PC3细胞上皮标记物E-cadherin的表达(p＜0.01)，上调间质标记物N-caderin(p＜0.05)、vimentin(p＜0.05)的表达，上调转录因子slug、snail(p＜0.05)的表达。DHT能够激活ERK1/2，MAPK/ERK1/2抑制剂U0126能够反转DHT所致的上述EMT标记物的变化。在AR阳性的LNCaP细胞中，DHT刺激对EMT指标无明显作用。
　　2.βKlotho在PC3、LNCaP、C4-2B三种细胞中均有表达，以LNCaP中的表达量最高，其表达量是PC3的2.24倍(p＜0.01)，是C4-2B的1.67倍(p＜0.01)。30例前列腺增生βKlotho的染色得分:10.15土0.29，30例前列腺癌βKlotho的染色得分:7.47±0.41，两者的差异表达具有统计学意义(p＜0.05)，高级别（Gleason评分≥7分）患者比低级别（Gleason评分≤6）患者的βKlotho表达量更低。通过对The Human Protein Altas数据库分析，发现前列腺癌中的βKlotho较正常前列腺组织的表达降低，与我们的研究结果一致。
　　3.卡方检验表明βKlotho的低表达与前列腺癌的高分级有关(p＜0.05)。βKlotho表达水平与患者的年龄、临床分期无关(p＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析法，log-rank检验表明βKlotho低表达患者生存率明显低于βKlotho中等表达和高表达患者。肿瘤高分期比低分期预后差，高分级与低分级之间无统计学差异。
　　4.PC3细胞中过表达βKlotho显著降低细胞的增殖能力，增加细胞的早期凋亡，抑制细胞的迁移、侵袭能力。LNCaP细胞中敲减βKlotho能够促进细胞增殖，抑制细胞早期凋亡，促进细胞的迁移与侵袭能力。
　　5.在PC3细胞中过表达βKlotho后能显著上调DHT所诱导的E-cadherin的降低作用(p＜0.05)，下调DHT所诱导的N-cadherin、vimentin、slug、snail的升高作用，这种效应在细胞免疫荧光实验中得到证实;LNCaP细胞敲减βKlotho后E-cadherin表达降低，N-cadherin、vimentin的表达升高，这种效应在细胞免疫荧光实验中得到证实。
　　6.裸鼠成瘤4周后，对照组的肿瘤体积为2436±790(mm3)，βKlotho过表达组肿瘤体积为1590±504(mm3)，差异具有统计学意义(p＜0.01)。βKlotho的过表达明显抑制PC3细胞的皮下移植瘤的生长。免疫组织化学表明，βKlotho过表达的裸鼠移植瘤中E-cadherin的表达增高了2.68倍(p＜0.01)，N-cadherin的表达降低了69.7％(p＜0.01)，snail的表达降低了46.1％(p＜0.01)。
　　结论：
　　1.雄激素对前列腺癌EMT的影响是AR依赖性途径和AR非依赖性途径综合作用的结果。
　　2.前列腺癌细胞系、前列腺癌组织中均存在βKlotho的表达，前列腺癌βKlotho表达较前列腺增生组织降低，βKlotho的低表达与前列腺癌的高分级有关，βKlotho的表达降低是前列腺癌患者生存的不利因素。
　　3.βKlothot通过抑制ERK1/2信号通路抑制雄激素/雄激素受体相关的EMT，在体内、体外实验中发挥抗前列腺癌作用。
　　4.βKlotho作为EMT的抑制因子，可作为晚期前列腺癌治疗的一个新的潜在靶点。
　　第二部分:二甲双胍上调βKlotho抑制前列腺癌上皮间质转化
　　目的：
　　首先研究二甲双胍与前列腺癌EMT、与前列腺癌AR信号通路之间的关系。鉴于二甲双胍与βKlotho均有降低血糖的作用，进一步研究两者潜在的关系，并对其机制作初步探究。
　　方法：
　　1.采用克隆形成实验、CCK8检测二甲双胍对于PC3、LNCaP细胞增殖的影响。
　　2.采用Western Blot检测二甲双胍对βKlotho，对EMT的影响。
　　3.采用组织块培养方法检测二甲双胍对EMT的影响。
　　4.采用RT-PCR检测二甲双胍对于AR转录活性的影响。
　　5.采用细胞免疫荧光方法检测二甲双胍对于AR细胞分布的影响。
　　6.GEO数据库分析AR蛋白与βKlotho DNA潜在联系。
　　结果：
　　1.二甲双胍抑制PC3、LNCaP细胞增殖，具有浓度和时间依赖性。
　　2.在PC3细胞中，二甲双胍能明显激活AMPK信号通路，降低AR的表达，上调E-cadherin的表达，下调N-cadherin的表达，这种效应在组织块培养中得到证实。有趣的是，二甲双胍能够明显上调βKlotho的表达，具有浓度依赖性。在PC3细胞中敲减βKlotho后，二甲双胍所致的E-cadherin的上调，N-cadherin的下调被逆转。
　　3.二甲双胍能够抑制DHT所致的LNCaP细胞AR转录的激活，包括AR以及下游PSA、NKX3.1 mRNA水平的降低。并且，二甲双胍能够抑制AR从细胞质到细胞核的转运。
　　4.GEO数据库分析提示AR蛋白与βKlotho DNA在外显子1和外显子2之间存在结合位点，DHT能够促进AR蛋白与βKlotho DNA的结合，而抗雄药物恩杂鲁胺能反转这一现象。
　　结论：
　　1.二甲双胍抑制前列腺癌细胞的增殖，上调βKlotho表达，抑制前列腺癌细胞的EMT，这种效应依赖于βKlotho的表达。
　　2.二甲双胍抑制AR信号通路的活性。
　　3.二甲双胍上调βKlotho的可能机制:二甲双胍通过下调AR的表达，抑制AR对于βKlotho启动子区域的抑制作用，刺激βKlotho转录、翻译，上调βKlotho表达。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 βKlotho抑制雄激素相关的前列腺癌上皮间质转化

第一章 前言

2．1 细胞培养

2．2 质粒构建与转染

2．3 SiRNA合成与转染

2．4 蛋白提取和蛋白免疫印迹(Western Blotting)

2．5 石蜡切片与免疫组织化学染色

2．6 CCK-8(Cell Counting Kit-8)细胞增殖实验

2．7 克隆形成实验

2．8 Transweli细胞迁移、侵袭实验

2．9 流式细胞仪凋亡检测

2．10 细胞划痕实验

2．11 细胞免疫荧光染色

2．12 裸鼠成瘤实验

2．13 统计学分析

第三章 实验结果

3．4 βKlotho表达与前列腺癌临床生物学行为及预后间的关系

3．5 上调βKlotho抑制前列腺癌细胞增殖，促进前列腺癌细胞凋亡，抑制细胞的迁移、侵袭

3．7 敲减βKlotho促进前列腺癌细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进细胞的迁移及侵袭

3．9 上调βKlotho抑制裸鼠前列腺癌移植瘤的生长，抑制前列腺癌上皮间质转化

第四章 讨论

第五章 结论

第六章 附图、附表

参考文献

第二部分 二甲双胍上调βKlotho抑制前列腺癌上皮间质转化

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 细胞培养

2．2 克隆形成实验

2．5 组织块培养

2．6 免疫组织化学染色

2．7 RNA提取、逆转录、实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)

2．8 细胞免疫荧光

2．9 统计学分析

第三章 实验结果

3．1 二甲双胍抑制前列腺癌细胞增殖，具有浓度、时间依赖性

3．4 二甲双胍抑制前列腺癌AR的蛋白表达，抑制AR的转录活性，抑制AR的细胞质核转运

3．5 二甲双胍上调βKlotho的机制可能和下调AR有关

第四章 讨论

第五章 结论

第六章 附图

参考文献

致谢

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