MicroRNA-203通过PDPN抑制下咽癌的生长及远端转移的研究

摘要

背景:
　　下咽癌(Hypopharyngeal cancer)是人头颈部常见恶性肿瘤之一。这些年来，随着医学诊断技术以及手术技术水平的提高，还有放疗、化疗、生物治疗等综合治疗水平的发展，患者的生存率却依然很低。据国外报道5年生存率仅为15％-30％。首要的原因是下咽癌患者就诊时有很大一部分已经是中晚期了，很多已经有颈部淋巴结的转移或邻近部位的侵犯，这主要与该疾病的发病位置隐秘，不易早期被注意到有关。其次是因为该肿瘤极易转移及复发，这也是治疗失败的主要原因。下咽癌的解剖部位注定了其对患者的生活质量、社会交流等重要方面会产生深刻的影响。如果肿瘤复发，对患者的生存、生活、家庭、经济等各个方面都会产生巨大的消极负面影响。如果可以早发现、早治疗，将有效的改善下咽癌患者的预后。由此可见，探寻下咽癌增殖转移的可能机制以及与之相关联的肿瘤因子，对于临床工作及患者预后具有十分重要的意义。
　　肿瘤的形成是在一系列突变基因叠加共同作用的、多步骤、多阶段的复杂过程。首先在多种类型的癌前组织中，某部分的基因发生突变，导致这些细胞获得单克隆或多克隆的生长优势，继而加上原癌基因、抑癌基因和DNA修复相关基因等发生一系列突变，更进一步促使癌前细胞转变为癌细胞，进而形成原发肿瘤。所谓恶性肿瘤，特点是脱离了原发的病灶，发生远处的扩散、转移。随着科技的进步，人们对miRNAs的研究不断深入，发现在肿瘤的发生、发展过程中其发挥着重要的调控作用。
　　微小RNA(miRNAs)是一类动、植物以及病毒内都普遍存在的，包含21～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA，与肿瘤的形成及发展密切相关。有些mi RNA具有致癌基因的功能，大部分具有抑制肿瘤的活性的功能。miRNAs可以识别特定的靶mRNA并与之结合，之后在转录后水平抑制翻译过程和/或促进靶基因mRNA的降解，以此来发挥其负性调控基因表达的作用。
　　目前已知的miRNAs已经达到千余种。miR-203是miRNAs中的重要一员，具有在上皮组织中特异性表达的特点，其在不同组织来源的恶性肿瘤中的表达有显著差别。miR-203基因序列定位于染色体上的不稳定脆性区域——14q32.33上，含有52种miRNA基因序列，参与编码人类目前已知约12％的miRNA。miR-203广泛地分布于人体的各种组织器官，但是具有组织分布差异性。miR-203在控制细胞增殖、凋亡、分化、祖细胞的干细胞潜力、应激反应、上皮细胞-间充质转化(EMT)、细胞侵袭和迁移过程中发挥相关功能。目前研究人员已经证明miR-203在一部分肿瘤中发挥抑癌微小RNA的作用。但是其在下咽癌中的作用特别是对下咽癌增殖转移机制的影响尚不清楚。
　　平足蛋白/淋巴管内皮细胞蛋白(Podoplanin，PDPN)是我们本次实验鉴定出的miR-203的一个靶基因。平足蛋白是一个小的具有大量O-糖链的细胞膜糖蛋白，属于黏蛋白家族。主要存在于淋巴管内皮细胞、Ⅰ型肺泡壁细胞和肾小球足细胞。人类很多肿瘤中发现平足蛋白水平升高或表达增加。在大多数肿瘤中，肿瘤细胞和成纤维细胞平足蛋白表达水平的升高与淋巴转移发生率增加和病人生存期缩短有关。平足蛋白在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。但对PDPN在下咽癌疾病中的研究则非常有限。
　　综上所述，我们发现miR-203和PDPN在下咽鳞状细胞癌组织中的表达水平与肿瘤的临床分期、淋巴结转移、患者的临床预后之间的相关性尚有待研究。本实验采用实时定量PCR的方法，测定miR-203和PDPN在人下咽组织和正常黏膜组织中的表达情况，分析miR-203和PDPN与下咽鳞癌的临床分期、淋巴结转移之间的关系。同时应用体外实验通过检测miR-203和PDPN对FaDu细胞增殖、迁移及侵袭功能的影响，进一步研究两者的生物学特性和相互作用。以期可以为下咽癌提供早期诊断和预后判断的分子生物学指标，并可以为下一步的肿瘤靶向治疗提供研究方向。
　　本实验检测了miR-203在下咽癌组织中的表达情况，研究了miR-203通过调控靶基因PDPN在下咽癌的转移及增殖中起的作用，并进一步探讨其作用机制。
　　第一部分:miR-203在下咽癌的表达及其对下咽癌发展的影响
　　目的:
　　1.研究下咽癌组织中miR-203的表达情况以及miR-203的表达量与肿瘤T分期、淋巴结转移的关系。
　　2.研究miR-203对下咽癌FaDu细胞系增殖、迁移及侵袭的影响。
　　方法:
　　以49例人下咽癌组织及18例正常咽腔黏膜组织为样本，qRT-PCR（实时定量PCR）法检测各样本中miR-203的表达。将肿瘤不同分期及有无淋巴结转移的各组加以比较分析。再以下咽癌FaDu细胞系为实验对象，通过包病毒实验转染miR-203或miR-NC慢病毒建立稳定细胞系。然后经qRT-PCR法检测miR-203的表达。使用细胞计数试剂Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞的增殖活性。运用伤口愈合实验及体外侵袭实验证实miR-203过表达的细胞与miR-NC过表达的细胞相比，细胞迁移及侵袭能力的改变。
　　结果:
　　miR-203在正常咽腔黏膜组织中的表达水平显著高于在下咽癌组织中的表达水平。miR-203表达强度随着下咽癌组织T分期的增高而降低。同时，通过对比淋巴结转移及为转移样本中miR-203的表达，证实其低表达与肿瘤的淋巴结转移具显著相关性。
　　在FaDu细胞中转染miR-203或miR-NC慢病毒建立稳定细胞系，经qRT-PCR检测证实miR-203在miR-203过表达的细胞显著上升。使用CCK-8每24 h检测一次细胞活性，实验结果证实与miR-NC过表达细胞相比，miR-203过表达细胞的细胞增殖活性显著降低。同时，伤口愈合实验及体外侵袭实验均证实miR-203过表达的细胞与miR-NC过表达的细胞相比，细胞的迁移及侵袭能力均减弱。即高水平的miR-203抑制下咽癌细胞的增殖，迁移及侵袭。
　　结论:
　　1.miR-203在下咽癌组织中低表达，并且其表达水平与肿瘤的T分期、淋巴结转移有关。
　　2.miR-203可以抑制下咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
　　第二部分:miR-203与PDPN在下咽癌组织中的关系研究
　　目的:
　　1.证实PDPN为miR-203的靶基因，并探讨两者的关系。
　　2.探讨PDPN在下咽癌组织的表达以及其表达量与肿瘤T分期、淋巴结转移的关系。
　　3.沉默PDPN，进行CCK-8细胞增殖活性实验、伤口愈合实验及体外侵袭实验，证实PDPN对下咽癌FaDu细胞系增殖、迁移及侵袭功能的影响。
　　4.利用细胞转染技术，通过比较miR-203过表达以及miR-NC过表达的FaDu细胞分别转染空载与PDPN后细胞的增殖活性、迁移及侵袭功能，探讨PDPN和miR-203的相互作用。
　　方法:
　　通过硅片检测，使用TargetScan Release7.1分析，鉴别出miR-203结合的PDPN的3'-UTR位点。之后根据荧光素酶报告基因实验构建荧光素酶报告基因，包括野生型及突变型。以下咽癌FaDu细胞系为实验对象，检测PDPN报告基因野生型及突变型的相对活性。使用qRT-PCR法检测正常咽腔黏膜组织及人下咽癌组织样本中PDPN的表达。运用蛋白免疫印迹实验进一步检测在miR-203过表达与阴性对照组中PDPN的表达水平。使用细胞计数实验检测细胞的增殖活性。运用伤口愈合实验及体外侵袭实验检测PDPN在各实验组及对照组中对细胞迁移及侵袭能力的影响。
　　结果:
　　miR-203结合PDPN的位点在3'-UTR区内。在miR-203过表达细胞中，野生型PDPN的报告基因活性很低，而突变型PDPN的报告基因活性在miR-203过表达细胞、miR-NC对照细胞中一致。人下咽肿瘤样本中PDPN的表达水平大量超出在正常咽腔黏膜样本中的表达水平，同时PDPN表达水平的上升与癌症T分期的上升及淋巴结转移相关。相关统计分析表明人下咽肿瘤样本中PDPN与miR-203的表达水平具负相关。蛋白免疫印迹实验进一步证实与miR-NC对照组相比，PDPN的表达水平在miR-203过表达细胞中下调。
　　与转染空载比较，FaDu细胞转染PDPN shRNA后PDPN表达降低。CCK-8细胞活性检测证实，与转染空载比较，PDPN敲除细胞的细胞活性显著降低。此外，伤口愈合实验及体外侵袭实验证明，与对照相比PDPN敲除的FaDu细胞系迁移及侵袭速度明显降低。
　　蛋白免疫印迹实验证实，与miR-NC+空载组及miR-203+PDPN组相比，PDPN的表达水平在miR-203+空载组中下调。CCK-8细胞活性检测同样证实miR-203+空载组细胞活性显著降低。相应的进行伤口愈合实验及体外侵袭实验证实miR-203+空载组的细胞的迁移及侵袭速度相比于miR-NC+空载组及miR-203+PDPN组降低。
　　结论:
　　1.PDPN是miR-203的直接下游靶基因。PDPN为重要的原癌基因，其高表达与肿瘤的分期、淋巴转移密切相关。
　　2.PDPN作为原癌基因促进下咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭。miR-203可抑制PDPN在下咽癌细胞中的表达。
　　3.PDPN过表达能够逆转miR-203对下咽癌细胞增殖，迁移及侵袭的抑制效果。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：miR-203在下咽癌的表达及其对下咽癌发展的影响研究背景

研究背景

材料和方法

结果

讨论

第二部分：PDPN与miR-203在下咽癌组织中的关系研究

研究背景

材料和方法

结果

讨论

结论

附录附图表

参考文献

相关文献综述 PDPN及其在肿瘤中的研究进展

致谢

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