对虾β抑制蛋白对Toll和Jak/Stat信号通路的调控及纤维蛋白原相关蛋白在对虾抗细菌免疫中的功能研究

摘要

脊椎动物的免疫系统由先天免疫和适应免疫组成，无脊椎动物缺乏特有的适应性免疫，主要依靠先天免疫抵御病原微生物的入侵。有关果蝇的先天免疫研究的比较深入，发现了果蝇中存在三条主要的免疫相关信号通路，Toll、IMD和Jak/Stat信号通路，有关这三条信号通路的调控也有相关报道。在其他无脊椎动物如对虾中，也存在类似的信号通路，但是关于这些信号通路调控的研究报道却很少。本论文主要研究了对虾中Toll和Jak/Stat信号通路的调控;另外还对感知和识别病原的模式识别受体纤维蛋白原相关蛋白在抗细菌免疫中的功能开展了研究。
　　1.β抑制蛋白通过调控Dorsal的核移位和转录活性来负性调控Toll信号通路
　　Toll信号通路在果蝇和哺乳动物先天免疫中起着非常重要的作用。Toll信号通路的激活和抑制在这些生物中受到精细的调控。尽管已经在对虾中发现了Toll信号通路的一些关键的分子元件，但是关于这条信号通路的功能和调控研究的很少。为了研究β抑制蛋白(β-arrestins)对Toll信号通路的调控，我们首先利用Staphylococcus aureus刺激对虾，检测Toll信号通路转录因子Dorsal的核移位变化和抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)的表达，建立了对虾中中Toll信号通路的激活模型，并证明该通路在对虾抗细菌免疫中发挥重要作用。之后我们发现β抑制蛋白(β-arrestins)通过两条途径负性调控Toll信号通路。β-Arrestins通过其arrestin-N结构域与Cactus的C-terminal PEST结构域相互作用;Cactus通过其ANK重复结构域和Dorsal的RHD结构域相互作用;进而通过Cactus形成β-arrestin-Cactus-Dorsal三聚体。这种复合体能够保护Cactus的磷酸化和降解，抑制Dorsal的转位入核，进而抑制Toll信号通路。β-Arrestins也可以通过arrestin-C结构域和非磷酸化胞外调节蛋白激酶(ERK)相互作用，从而抑制ERK的磷酸化，进而影响Dorsal的转位入核和Dorsal的Serine276磷酸化，影响了Dorsal的转录活性。我们的研究说明β-arrestins通过抑制Dorsal的转位入核，磷酸化和转录活性来负性调节Toll信号通路。
　　2.β-Arrestin1与TC45互作使Stat去磷酸化进而抑制抗菌肽的表达
　　信号通路中关键分子的磷酸化与去磷酸化在调控信号通路级联反应中具有重要作用。在Jak/Stat通路中，损坏磷酸酶活性会导致信号转录激活因子Stat处于持续激活的状态。在哺乳动物中，Stat家族成员可以被同一种磷酸酶去磷酸化。哺乳动物中发现了多种Stat分子，在甲壳动物中仅发现了一种Stat，其与哺乳动物中的Stat5a/b类似。截至目前，对虾中关于Stat信号通路调控的报道很少。本文研究发现，β-arrestin1与T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(TC45)在细胞核中相互作用促进Stat去磷酸化从而抑制Stat信号通路的转录。首先，我们发现在细菌刺激条件下，Stat转移至细胞核中上调抗菌肽的表达。β-Arrestin1进入血细胞细胞核中，招募TC45到Stat上，形成β-arrestin1-TC45-Stat复合体，使Stat有效、快速的去磷酸化。当干扰掉β-arrestin1再用鳗弧菌Vibrio anguillarum刺激后，TC45与Stat相互作用减弱，Stat磷酸化水平升高。在形anguillarum刺激下，β-arrestin1在细胞核中直接与Stat相互作用并招募TC45到Stat上，加速Stat的去磷酸化，减低其转录活性。更进一步研究发现，β-arrestin1与TC45可以通过Stat信号通路影响AMPs的表达。以上结果表明，在对虾抗细菌免疫中中，β-arrestin1和TC45通过使Stat的去磷酸化而减少抗菌肽的表达，实现对Jak/Stat通路的负调控。
　　3.一种纤维蛋白原相关蛋白参与对虾的抗细菌免疫
　　在无脊椎动物中，纤维蛋白原相关蛋白(FREPs)在先天免疫中具有重要的功能。本文中，我们从日本囊对虾中鉴定出一种FREP，并将其命名为MjFREP2。MjFREP2的全长为1138 bp，包括954 bp的开放阅读框，编码317aa，由一个信号肽和一个纤维蛋白原样结构域组成。MjFREP2在血细胞，心脏，肝胰腺，鳃，胃和肠中都有能检测到。当对虾受到V.anguillarum和S.aureus刺激后，MjFREP2在血细胞中上调表达。凝集实验和结合实验结果显示重组表达的MjFREP2能结合细菌和多糖。免疫细胞化学实验结果显示MjFREP2蛋白主要分布在正常对虾血细胞的细胞质中，在受到细菌刺激后，向细胞膜移动或分泌到细胞外。分泌性的MjFREP2能结合到对虾血淋巴中的细菌表面。过表达的MjFREP2能通过促进血细胞吞噬来促进细菌的清除。当干扰掉Mj FREP2后，这种功能被破坏，对虾的死亡率与对照相比显著升高。这些结果说明MjFREP2在日本囊对虾抗细菌免疫中具有重要的功能。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 无脊椎动物先天免疫研究进展

1．无脊椎动物的Toll信号通路

2．无脊椎动物的IMD信号通路

3．无脊椎动物的Jak／Stat信号通路

4．抑制蛋白arrestins对调控信号通路机制的研究

5．纤维蛋白原相关蛋白FREPs

6．本论文研究的目的及意义

第二章 β抑制蛋白通过调控Dorsal的转位和转录活性来负性调控Toll信号通路

一、前言

二、材料和方法

1．试剂和仪器

2．细菌刺激和样品的收集

3．cDNA的克隆和序列分析

4．组织的提取和半定量RT-PCR水平和western blot水平的表达模式

5．重组蛋白的表达和抗体的制备

6．荧光实时定量PCR反转得到的cDNA

7．RNAi实验

8．核质提取的实验

9．细菌清除和存活率的实验

10．Pull-down实验

11．免疫细胞化学实验

12．免疫共沉淀

13．PD98059抑制剂实验

三、结果

1．在S.aureus刺激后Toll信号通路被激活并在对虾抗细菌免疫中起着关键的作用

2．βArrl，βarr2和ERK参与了Toll信号通路的调控

3．βArrs和Cactus作用形成βarr-Cactus-Dorsal三聚体

4．βArrs的N-terminal结构域与Cactus的PEST结构域具有相互作用

5．用GST-binding柱料和His-binding柱料来做pull down实验

6．Cactus的ANK结构域和Dorsal的RHD结构域作用及βarrs，Cactus和Dorsal形成复合物

7．βArrs和非磷酸化的ERK相互作用抑制ERK的磷酸化

8．βArrs的C-terminus与ERK作用

9．ERK影响细胞核中Dorsal的磷酸化水平

四、讨论

第三章 β-Arrestin 1与TC45互作使Stat去磷酸化进而抑制抗菌肽的表达

一、前言

二、材料和方法

1．试剂和仪器

2．组织分布

3．分子克隆和序列分析

4．重组表达和抗体制备

5．RNAi实验

6．细菌的清除和死亡率实验

7．Western blot分析

8．免疫细胞化学实验

9．免疫共沉淀

10．抑制剂实验

11．Pull-down实验

13．βArrl和TC45过表达

三、结果

1．对虾中βarrs，TC45和Stat的组织分布

2．Stat参与了对虾抗细菌免疫

3．干扰掉βarrl和TC45后Stat的磷酸化水平升高

4．βArrl和TC45通过使活化的Stat的去磷酸化负性调控了Stat的抗细菌免疫

5．βArrl，TC45和Stat三者之间能发生相互作用

6．βArrl的C-terminal结构域和Stat的Link结构域作用

7．TC45分别与Stat599-800，βarrl的C-terminal结构域作用

8．βArrl和TC45影响Stat所调控的AMPs的表达

四、讨论

第四章 一种纤维蛋白原相关蛋白参与对虾的抗细菌免疫

一、引言

二、材料和方法

1．试剂和仪器

2．病原免疫刺激和组织样提取

5．序列BLAST分析和相似性比较

6．MjFREP2蛋白的表达和纯化及抗体的制备

7．半定量PCR和荧光定量PCR

8．Western blot分析

10．细菌结合实验

11．酶联免疫反应实验(ELISA)

12．免疫细胞化学实验

13．细菌清除实验

14．荧光标记细菌和吞噬实验

15．RNAi实验

16．对虾死亡率实验

1．MjFREP2基因克隆和序列分析

1．2 MjFREP2广泛分布各个组织中及受到细菌刺激之后上调表达

1．3 MjFREP2在钙离子存在下能够凝集细菌

1．4 MjFREP2通过结合多糖结合到细菌的表面

1．5 MjFREP2被血细胞分泌出去并结合到血淋巴中的细菌上

1．6 在对虾体内，MjFREP2促进了细菌的清除

1．7 MjFREP2促进了对虾血细胞的吞噬

四、讨论

论文创新点总结

参考文献

致谢

在读期间发表的文章