纺锤链霉菌SD-07中多烯抗真菌抗生素济南霉素的生物合成及基因敲除初探

摘要

纺锤链霉菌（Streptomyces netropsis）SD-07是本实验室2007年发现的一株放线菌，它所产的多烯大环内酯类抗生素是以五烯和七烯为主的混合物，五烯含量最高，并且五烯类的抗生素已经解析出化学结构，命名为济南霉素(Jinanmycin)，相比两性霉素B及制霉菌素，SD-07所产抗生素有更强的抗真菌活性，具有开发为新型抗真菌抗生素的潜力，因此有必要对济南霉素在SD-07中的生物合成路径以及其合成相关PKS基因簇的基因敲除工作进行一系列研究与探索。
　　本文工作如下:
　　1.纺锤链霉菌SD-07全基因组扫描测序完成，并对济南霉素在SD-07中的生物合成进行了详细生物信息学分析
　　SD-07基因组碱基总数为7593656bp，经antismash预测分析，共得到46个基因簇，其中cluster32最有可能为纺锤链霉菌SD-07多烯大环内酯类抗生素的编码基因簇，定位于4266507-4419580 bp，总大小153074bp，其中PKS相关基因定位于4286507-4388174bp，总大小101667bp，推测为合成济南霉素的基因簇。接下来对济南霉素在SD-07中的生物合成路径进行了详细的描述与生物信息学分析:济南霉素大环内酯环的合成开始于JinA，经JinB、JinC、JinD、JinE和JinF一步步聚合，最后由JinF-TE将聚酮长链从PKS上水解下来并环化成大环内酯环，接下来对该大环内酯环进行后修饰，JinⅠ将C16甲基支链氧化成羧基，通过GDP-甘露糖脱水酶JinGⅢ，氨基转移酶JinGⅡ以及一些初级代谢中的酶将果糖-6-磷酸转化为GDP-放线菌糖胺，然后通过JinGⅠ将GDP-放线菌糖胺与两性霉素的糖苷配基核心相结合。最后可由JinMⅠ和JinMⅡ这两种ABC型转运蛋白负责将济南霉素主动运输到纺锤链霉菌SD-07外。本研究对SD-07的基因敲除工作奠定了基础。
　　2.成功构建两个SD-07敲除载体，并进行基因敲除尝试
　　在复制型质粒pJTU1278的基础上成功构建了敲除载体pJTU1278-⊿5883与pJTU1278-⊿2166，尝试用接合转移，电转化及PEG介导的原生质体转化法对纺锤链霉菌SD-07的基因敲除进行一系列尝试，并且对实验条件进行了一系列优化，但是最终都没能得到正确转化子。对于以上结果，我们认为复制型质粒不适合转入纺锤链霉菌SD-07。
　　3.采用Red/ET重组对SD-07中PKS基因簇的克隆进行了探索
　　Red/ET重组工程是在E.coli细胞内利用同源重组对DNA序列进行精确修饰的基因工程技术。通过Red/ET重组工程对多烯大环内酯类抗生素的相关PKS基因簇克隆进行了一系列尝试，将110kb左右的相关PKS基因簇通过酶切分为两部分进行克隆，较小的DNA片段为40kb左右，正确重组并成功筛选得到;然而当尝试将65kb左右的较大DNA片段与载体重组时，虽然成功长出很多克隆，但是当我们对其一进行筛选时，却得不到我们想要的正确克隆;再进行了多次尝试后，依然没有正确的克隆，分析可能是65kb的DNA片段较大，不容易进行克隆。我们又重新进行了实验方案的设计，将65kb的片段酶切成20kb左右以及40kb左右的片段进行克隆，对40kb左右的片段进行克隆时，同样没有出现正确的克隆。分析原因很可能是因为纺锤链霉菌SD-07某些基因的表达产物对Ecoli有毒，导致重组成功的克隆都死掉了。通过文献查询发现有过这种情况发生。
　　尽管目前SD-07基因敲除的工作没有完成，但是本研究对今后的工作提供了一系列指导，本实验室会继续进行SD-07基因敲除这个难题的攻克。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 链霉菌及多烯大环内酯类抗生素简介

1．2 济南霉素简介

1．3 链霉菌基因敲除方法简介

1．4 Red／ET重组工程简介

1．4．1 Red／ET重组的原理

1．4．2 Red／ET重组工程的操作步骤

第二章 多烯大环内酯类抗生素济南霉素在纺锤链霉菌SD-07中的生物合成

2．1 济南霉素简介

2．2 济南霉素生物合成

2．2．1 纺锤链霉菌SD-07全基因组扫描测序

2．2．2 PKS基因

2．2．3 PKS后修饰和运输

2．2．4 细胞色素P450酶

2．2．5 糖基化

2．2．6 输出

2．2．7 其他基因

第三章 纺锤链霉菌SD-07敲除载体的构建及基因敲除初探

3．1 研究背景

3．2 实验材料

3．2．1 菌株及质粒

3．2．2 PCR引物

3．2．3 培养基及化学试剂

3．2．4 抗生素及使用浓度

3．3 实验方法

3．3．4 敲除载体的构建

3．4 结果与讨论

3．4．1 敲除载体pJTU1278-△42166以及pJTU1278-△5883的构建

3．4．2 确定抗生素工作浓度

3．4．3 接合转移条件摸索

3．4．4 电转化条件摸索

3．4．5 PEG介导的原生质体转化法条件摸索

3．5 本章总结

第四章 纺锤链霉菌SD-07中PKS基因簇克隆的探索

4．1 研究背景

4．2 实验设计

4．3 实验材料

4．3．2 PCR引物

4．3．3 培养基及化学试剂

4．3．4 抗生素及使用浓度

4．3．5 实验仪器

4．3．6 DNA序列分析软件

4．4 实验方法

4．4．1 质粒DNA提取：BACs和质粒

4．4．2 链霉菌基因组DNA提取

4．4．3 纺锤链霉菌SD-07 Large part克隆

4．4．4 纺锤链霉菌SD-07 Small part克隆

4．5 实验结果与分析讨论

4．5．1 Large part克隆及限制酶切筛选分析

4．5．2 Small part克隆及限制酶切筛选分析

4．6 本章总结

全文总结与展望

参考文献

致谢