模式识别受体NLRP3和组蛋白去甲基化酶PHF8介导胃癌发生发展的功能与机制

摘要

研究背景:
　　胃癌在发展中国家是癌症死亡的主要原因，是影响我国人民健康的重大疾病。早期诊断困难是胃癌预后较差的主要原因。据美国国立癌症研究所“监测、流行病学和结果数据库”SEER报道，2008年到2016年之间，Ⅰ期胃癌患者的五年生存率为66.9％，而Ⅳ期患者的五年生存率骤降至5％，然而63％的胃癌患者一经诊断即为晚期。因此揭示胃粘膜恶性转化及侵袭转移的机制，是制定胃癌早期防控策略以及确定新的治疗靶点的重要依据。
　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H pylori）感染是胃癌发生的一个危险因素，已被世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)认定为一级致癌原，流行病学资料也显示根除幽门螺杆菌感染可降低胃癌风险率，幽门螺杆菌致癌机制仍在探索中。然而，有一条规律值得关注，幽门螺杆菌相关的恶性转化存在病理节点明晰的渐进式演化过程，即“慢性浅表性胃炎（可控性炎症）→慢性萎缩性胃炎伴肠上皮化生（非可控性炎症）→不典型增生（癌前病变）→胃癌”。
　　胃粘膜恶性转化是胃内环境因子（外因）与宿主调控应答（内因）交互作用的结果。幽门螺杆菌可以通过MMP-2/9、CCL2等招募免疫细胞至胃黏膜组织启动免疫应答，促进胃部炎症进展。炎症部位浸润的免疫细胞可以通过产生IL-1、IL-6和TNF-α等促进炎症向癌症的转化。因此“幽门螺杆菌—胃粘膜上皮细胞—免疫细胞”构成的“胃区域感染炎症微环境”是炎癌转化以及胃癌进展的趋动力。
　　宿主通过模式识别受体(PRRs)感应病原微生物感染，PRRs识别病原微生物并向下游传递信号，释放成熟促炎因子如TNF-α、IL-6、IL-1β，引发机体炎症反应。已知有以下几种模式识别受体Toll样受体(TLRs: TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9等)，NOD样受体（NLRs: NOD1、NOD2和NLRP3等），C-型凝集素受体(CLRs)和维甲酸诱导基因（RLRs: RIG-1和MDA-5）参与调节胃癌的发生。其中NOD样受体在感知幽门螺杆菌感染并介导炎性响应与恶性转化中发挥作用的作用需要更多的探究。我们通过在OncoMine数据库中对胃癌各种类型的NOD样受体分子进行筛查，发现NLRP3在各种类型的胃癌中表达显著上调。NLRP3又称cryopyrin、PYPAF1或Nalp3，是NLR家族成员之一，与多种人类炎症与自身免疫病发生密切相关。NLRP3炎性小体与肠道肿瘤、肝细胞癌和黑色素瘤等肿瘤密切相关，此外NLRP3基因多态性和胃肠道肿瘤风险相关。幽门螺杆菌可激活NLRP3炎性小体，导致促炎因子IL-1β释放。以上研究结果提示幽门螺杆菌感染激活的NLRP3炎性小体增强了胃癌风险性。然而，NLRP3与胃粘膜恶性转化的内在规律尚不明了。
　　组蛋白修饰在癌症的发生和进展过程中的作用越来越受到大家的关注，很多研究将靶向组蛋白去甲基化酶作为治疗癌症的新策略。我们通过对Kaplan-Meier Plotter数据库中876例胃癌预后和组蛋白去甲基化酶相关性分析，发现两种组蛋白去甲基化酶KDM5C和PHF8与胃癌预后相关性最强，而KDM5C和胃癌之间的关系已有报道，因此我们重点关注组蛋白去甲基化酶PHF8是否参与胃癌的进展过程。作为一个转录共激活子，PHF8是含有Jmjc结构域的组蛋白去甲基化酶成员之一。本研究立足于解析幽门螺杆菌促进组蛋白去甲基化酶PHF8表达介导胃癌进展的调控机制。
　　研究目的:
　　（一）从感染炎症微环境的角度解析模式识别受体NLRP3高表达介导胃区域炎癌转化的调控机制。
　　（二）解析蛋白去甲基化酶PHF8介导胃癌侵袭转移与进展的调控机制。
　　方法和结果:
　　（一）幽门螺杆菌感染抑制组成性表达的miR-22促进NLRP3表达，进而在巨噬细胞和胃上皮细胞中分别通过炎性小体依赖性（成熟释放IL-1β）与炎性小体非依赖性（NLRP3入核转录调控CCND1）两类机制，共同介导胃区域炎癌转化。
　　1.通过在OncoMine数据库中对胃癌各种类型的NOD样受体分子进行筛查，发现NLRP3在各种类型的胃癌中表达显著上调。通过Western-blot实验发现胃癌中NLRP3表达显著高于癌旁正常组织，胃癌细胞系中NLRP3表达显著高于永生化的胃上皮细胞系（GES-1）。实时定量PCR分析发现胃癌中NLRP3表达显著高于萎缩性胃炎组织，免疫组化分析发现NLRP3在胃炎向胃癌进展的过程中逐步升高，并且NLRP3高表达的胃癌患者预后较差。体外克隆形成和体内裸鼠成瘤实验发现胃癌细胞系中NLRP3高表达后增殖能力显著升高。
　　2.NLRP3在巨噬细胞中可被激活参与形成NLRP3炎性小体，进而促进IL-1β的释放。体外克隆形成和Edu实验发现IL-1β可显著促进胃上皮细胞的增殖。
　　3.利用共聚焦显微镜在胃上皮细胞中观察到NLRP3出现在细胞核中，分离胞浆胞核蛋白进行Western-blot发现IL-1β可显著促进NLRP3的入核。Ensemble数据库提示CCND1启动子区存在两个NLRP3的结合位点。实时定量PCR和Western-blot发现NLRP3高表达后CCND1表达明显上调，而NLRP3干扰后CCND1表达明显下调。双荧光素酶和Chip实验证实NLRP3和CCND1的启动子区域有结合。
　　4.通过对胃癌和萎缩性胃炎标本的miRNA芯片分析和TargetScan预测一个炎癌转化中明显下调并有NLRP3潜在结合位点的miRNA，即miR-22。实时定量PCR分析发现胃癌中miR-22表达显著低于萎缩性胃炎组织，胃癌细胞系中miR-22表达亦显著低于永生化的胃上皮细胞系（GES-1）。实时定量PCR和Western-blot发现miR-22的类似物(mimics)可明显抑制NLRP3的表达，反之miR-22抑制物(inhibitor)则可明显上调NLRP3的表达。双荧光素酶实验发现miR-22的类似物(mimics)可明显抑制NLRP3的3'UTR活性，反之miR-22抑制物(inhibitor)则可明显上调NLRP3的3'UTR活性。
　　5.Western-blot发现在巨噬细胞中，miR-22 mimics可显著抑制LPS所诱导的NLRP3的表达。Western-blot和ELISA证实在巨噬细胞中，miR-22 mimics可显著抑制LPS和ATP诱导的NLRP3炎性小体激活以及IL-1β的释放。
　　6.体内裸鼠成瘤实验证实miR-22类似物可以显著逆转NLRP3高表达胃癌细胞的增殖能力，同时显著抑制NLRP3和CCND1在胃癌细胞中的表达水平。
　　7.实时定量PCR和免疫组化分析发现NLRP3在幽门螺杆菌阳性的萎缩性胃炎患者中表达明显高于阴性者。实时定量PCR和Western-blot也证实在胃癌细胞系中，幽门螺杆菌可明显诱导NLRP3的表达，而在巨噬细胞中还可以诱导NLRP3炎性小体的激活以及IL-1β的释放。动物实验证明幽门螺杆菌在体内亦可诱导NLRP3的表达。此外，幽门螺杆菌和IL-1β均可显著抑制上皮细胞和巨噬细胞中miR-22的表达，从而和NLRP3表达之间形成一个正反馈，促进炎癌转化。
　　（二）PHF8和β-catenin共同结合到上皮间质转化EMT相关基因vimentin启动子区促进其转录，进而促进胃癌的侵袭转移与进展。
　　1.通过对Kaplan-Meier Plotter数据库中876例胃癌预后和组蛋白去甲基化酶相关性分析，发现PHF8与胃癌预后相关性最强。通过对GEO数据库分析和免疫组化分析以及Western-blot发现胃癌中PHF8的表达明显高于癌旁正常组织。Western-blot实验发现胃癌细胞系中PHF8表达显著高于永生化的胃上皮细胞系(GES-1)。
　　2.通过裸鼠皮下成瘤以及尾静脉注射实验发现PHF8促进胃癌细胞的增殖和转移能力。
　　3.体外克隆形成，创伤愈合实验以及transwell实验证明PHF8干扰后胃癌细胞的增殖和转移能力均明显下降;PHF8高表达后胃癌细胞的增殖和侵袭能力增强，而PHF8组蛋白去甲基化酶活性突变的高表达质粒(H247A)组这种效应得到逆转。
　　4.Western-blot发现PHF8干扰后上皮标志物(E-cadherin，ZO-1)明显上调，间质标志物（vimentin，ZEB-1和Slug）明显下调，而PHF8高表达后则相反，H247A组则可逆转PHF8高表达的效应。通过对GEO数据库分析发现在45对胃癌和癌旁组织中PHF8的表达和vimentin，ZEB-1和Slug均明显正相关。实时定量PCR发现PHF8干扰后vimentin mRNA水平明显下降，而PHF8高表达后则相反，H247A组则可逆转PHF8高表达的效应。双荧光素酶实验和Chip证明PHF8可以和vimentin启动子区结合。IP证明PHF8和β-catenin存在物理性结合，
　　5.免疫组化发现PHF8和vimentin在胃癌中的表达存在共定位，并且PHF8的表达在进展期胃癌以及转移淋巴结中明显增加。通过对免疫组化结果进行分析发现，PHF8的表达和vimentin表达之间明显正相关，且与肿瘤的大小，进展程度，淋巴结转移，有无远处转移以及TNM分期均有明显相关性。
　　6.实时定量PCR和免疫组化分析发现PHF8在幽门螺杆菌阳性的萎缩性胃炎患者中表达明显高于阴性者。实时定量PCR也证实在胃癌细胞系中，幽门螺杆菌可明显诱导PHF8的表达，动物实验证明幽门螺杆菌在体内亦可诱导PHF8的表达。
　　研究结论:
　　（一）我们证实miR-22是NLRP3表达以及NLRP3炎性小体激活的负性调节因子，miR-22通过抑制巨噬细胞和上皮细胞中的NLRP3表达在调节胃部微环境和稳态中发挥作用。幽门螺杆菌通过抑制组成性表达的miR-22进而促进NLRP3表达介导感染炎症与恶性转化。因此，靶向miR-22调节NLRP3的表达在胃癌的干预过程中具有重要意义。
　　（二）胃癌中高表达的PHF8促进细胞增殖和侵袭，且与胃癌患者的较差预后相关。PHF8可以与和β-catenin共同结合到vimentin启动子区促进其转录，进一步促进胃癌的进展。因此，我们揭示了胃癌进展的一个新机制，提示PHF8也是胃癌防治过程中的一个潜在靶点。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 模式识别受体NLRP3在幽门螺杆菌感染相关胃粘膜上皮细胞恶性转化过程中的功能与机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附录

参考文献

第二部分 组蛋白去甲基化酶PHF8在胃癌进展过程中的功能与机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

附录

参考文献

致谢

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