海洋细菌来源的新型糖胺聚糖降解酶的筛选、鉴定与应用

摘要

糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）又称为粘多糖，是由重复单位组成的直链多糖。根据其二糖单位的不同，糖胺聚糖又被分为透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)，肝素/硫酸乙酰肝素（Heparin/Heparan Sulfate，Hep/HS），硫酸软骨素/硫酸皮肤素(Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate，CS/DS)，硫酸角质素(Keratan Sulfate，KS)。糖胺聚糖常常由于各种修饰酶的作用使糖链变得异常复杂，主要表现为D-葡萄糖醛酸在C5-差向异构酶的作用下转变为L-艾杜糖醛酸，糖链中不同部位羟基（-OH）和氨基(-NH2)的硫酸化，以及己糖胺二位氨基的乙酰化等。糖胺聚糖结构的复杂性赋予其功能的多样性，不同的结构具有不同的功能。
　　糖胺聚糖广泛存在于动物细胞表面和细胞基质中，常常通过与各种蛋白的相互作用参与了细胞的增殖分化、细胞间的识别、细胞转移、组织形态发生、癌变等各种生理和病理过程。糖胺聚糖所具有的一系列重要的生物学功能使其成为重要的生物活性分子，在医药及功能食品中得到广泛应用，如肝素、硫酸软骨素、透明质酸等。但由于糖胺聚糖结构的不均一性，特别是硫酸化糖胺聚糖结构的高度复杂性，使不同来源和不同批次的同一种糖胺聚糖在活性上存在很大差异。近年来的大量研究表明，糖胺聚糖的生物功能是通过多糖链中具有特殊结构的功能区与特定蛋白的特异相互作用来实现的，同一多糖链中存在不同结构的功能区，与不同的蛋白相互作用可以行使不同的功能。因此通过运用底物特异性的糖胺聚糖内切酶选择性的部分降解糖胺聚糖多糖链，制备结构均一或相对均一的特定功能区寡糖;通过运用底物特异性糖胺聚糖硫酸酯酶可以对特性功能区寡糖进行改造和修饰;通过综合运用底物特异性糖胺聚糖内切酶和外切酶可以对特性功能区寡糖进行测序。这些具有特异性的糖胺聚糖工具酶不仅在糖胺聚糖构效关系研究和寡糖制备中具有重要作用，并且在神经系统损伤治疗中也有重要作用。但是目前可以利用的糖胺聚糖工具酶屈指可数，因此寻找新型糖胺聚糖工具酶对于糖胺聚糖构效关系研究具有重要作用。
　　海洋作为生命的起源，存在大量的生命形式。海洋中存在大量的结构多样的糖胺聚糖，但是之前并没有相关糖胺聚糖降解酶的研究和报道。本论文以硫酸软骨素为唯一碳源，在海泥中筛选出一株高效降解糖胺聚糖的菌株并进行了基因测序。通过生物信息学分析发现了一系列新型糖胺聚糖工具酶基因，并对这些基因进行了深入研究。主要研究成果包括以下几个方面:
　　(a)糖胺聚糖降解菌的筛选:以鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素CS-C为唯一碳源，从海泥中筛选得到15株多糖降解菌，其中编号为FC509的菌株表现为对褐藻胶、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、肝素等多种多糖的降解和利用活性。因此本论文重点对FC509菌株进行研究，通过对其进行全基因组测序和生物信息学分析，发现了一系列与糖胺聚糖降解利用相关的酶基因，并着重对其中的多个降解酶基因进行了深入研究。
　　(b)内切型糖胺聚糖裂解酶HCLase的相关研究:将HCLase基因构建到大肠杆菌表达载体中异源表达，并利用镍柱进行纯化。底物降解实验表明:该酶具有高效降解HA和CS的活性，因此被命名为HCLase。基本酶学性质研究表明:HCLase与已报道的糖胺聚糖降解酶不同，其具有嗜盐特性，这与它来源于海洋细菌有关，切表现出良好的温度和pH稳定性。底物降解模式分析表明:HCLase是一个内切型糖胺聚糖裂解酶，最小底物是4糖，最小产物是2糖。同时我们对HCLase不能降解的四糖进行了序列测定，其结构为A4,5HexUAα1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)，这个结果揭示CS糖链中葡萄糖醛酸二位羟基的硫酸化会抑制HCLase对糖苷键的有效切割。HCLase的最大的优点是具有超高的酶活和良好的稳定性，这些特性使其成为具有巨大应用潜力的新型糖胺聚糖工具酶。
　　(c)外切型糖胺聚糖裂解酶HCDLase的相关研究:将HCDLase基因构建到大肠杆菌表达载体pET30a中异源表达，并运用亲和层析柱对异源表达的酶进行了纯化。酶学性质研究和底物降解模式分析表明:该酶具有典型的外切型酶活性，可以从糖链的还原端有效降解HA、CS和DS，但不能降解Hep和HS，因此被命名为HCDLase。进一步的研究表明:HCDLase可以降解还原端荧光标记的硫酸化CS寡糖并产生二糖，但是不能降解荧光标记的DS和HA寡糖，这说明糖苷键类型和硫酸化程度影响HCDLase的降解活性。最后我们运用这种酶成功的对系列硫酸软骨素六糖和八糖进行了测序。上述一系列研究结果表明:HCDLase作为一个新型的外切型糖胺聚糖裂解酶，在糖胺聚糖的构效关系研究，特别是复杂CS功能寡糖测序中具有重要的应用价值。
　　(d)新型内切型糖胺聚糖硫酸酯酶4-O-Endosulfatase的相关研究:将该硫酸酯酶基因构建到大肠杆菌表达载体pET30a中，并进行诱导表达和分离纯化。基本酶学性质研究表明:该酶在最适反应条件(30℃，pH8.0)下具表现出强的CS和DS硫酸酯酶活性;底物降解模式分析表明:该酶与已报道的CS/DS硫酸酯酶不同，不仅可以高效去除糖链端基的GalNAc上4位硫酸基团，而且还可以有效去除多糖链内部的4位硫酸根。多底物降解分析显示:该酶可有效去除多种CS和DS多糖链中的4位硫酸根，去除率在17-65％之间，硫酸基团的去除率与糖链的硫酸化模式密切相关。作为第一个被深入研究的CS/DS内切型硫酸酯酶，4-O-Endosulfatase在CS/DS构效关系研究和糖链硫酸化修饰调节中具有重要应用价值。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 本章引论

1．2 CS/DS/HA糖链降解酶

1．2．1 透明质酸降解酶

1．2．2 硫酸软骨素降解酶

1．2．3 新型糖胺聚糖降解酶

1．2．4 HAase和CSase的命名问题

1．3 CS/DS硫酸酯酶

1．3．1 外切型硫酸酯酶

1．3．2 内切型硫酸酯酶

1．3．3 硫酸酯酶的作用

1．4 选题意义

1．5 论文结构

参考文献

第二章 海洋来源糖胺聚糖降解菌的筛选、鉴定及基因组DNA序列分析

2．1 材料与试剂

2．1．1 材料

2．1．2 试剂

2．1．3 人工海水培养基的配制

2．2 实验方法

2．2．1 糖胺聚糖降解菌的筛选

2．2．2 降解菌的多糖利用能力分析

2．2．3 糖胺聚糖降解菌的分子鉴定

2．2．4 降解菌胞外粗酶的制备

2．2．5 胞外粗酶降解多糖的作用分析

2．2．6 降解菌的基因组DNA制备

2．2．7 降解菌的全基因组DNA测序与分析

2．3．1 降解菌的多糖利用能力

2．3．2 FC509菌株的鉴定

2．3．3 FC509胞外粗酶的多糖降解活性

2．3．4 降解菌的全基因组测序与分析

2．4 本章小结

参考文献

第三章 新型糖胺聚糖降解酶的表达与纯化

3．1 材料与试剂

3．1．1 材料

3．1．2 试剂

3．2 实验方法

3．2．1 糖胺聚糖降解酶基因的序列分析

3．2．2 糖胺聚糖降解酶基因异源表达载体的构建

3．2．3 糖胺聚糖降解酶的异源表达及表达条件的优化

3．2．4 重组蛋白的表达与纯化

3．3 结果与分析

3．3．1 糖胺聚糖降解酶基因及蛋白分析

3．3．2 糖胺聚糖降解酶的异源表达与纯化

3．4 本章小结

参考文献

第四章 新型内切型糖胺聚糖裂解酶HCLase的鉴定

4．1 材料与试剂

4．1．1 材料

4．1．2 试剂

4．2 实验方法

4．2．1 糖胺聚糖裂解酶HCLase底物专一性分析

4．2．2 重组蛋白最适反应条件分析

4．2．3 重组蛋白HCLase的酶活测定

4．2．4 裂解酶HCLase底物降解模式

4．2．5 裂解酶HCLase最终产物的质谱分析

4．2．6 糖胺聚糖聚合度均一性寡糖制备

4．2．7 HCLase抗性四糖的收集及测序

4．2．8 荧光标记对HCLase降解的影响

4．2．9 HCLase活性位点分析

4．3．1 重组酶的底物特异性分析

4．3．2 最适反应特性分析

4．3．3 HCLase的多糖降解特性

4．3．4 最终产物分析

4．3．5 HCLase抗性四糖结构测定

4．3．6 荧光标记对HCLase活性的影响分析

4．3．7 HCLase活性位点分析

4．4 本章小结

参考文献

第五章 新型外切型糖胺聚糖裂解酶HCDLase的鉴定

5．1．1 材料

5．1．2 试剂

5．2 实验方法

5．2．1 重组蛋白HCDLase底物专一性分析

5．2．2 裂解酶HCDLase最适反应条件分析

5．2．3 裂解酶HCDLase的酶活测定

5．2．4 外切酶活性鉴定

5．2．5 最终产物的质谱分析

5．2．6 结构均一的CS四糖以及六糖制备

5．2．7 荧光标记的影响

5．2．8 外切型糖胺聚糖裂解酶HCDLase的切割方向分析

5．2．9 HCDLase降解荧光标记CS四糖分析

5．3 结果与分析

5．3．1 HCDLase底物特异性分析特性

5．3．2 最适反应特性分析

5．3．3 裂解酶HCDLase的多糖降解特性

5．3．4 裂解酶的最终产物分析

5．3．5 结构均一的糖胺聚糖四糖和六糖的制备和测序

5．3．6 荧光标记的影响

5．3．7 外切型糖胺聚糖裂解酶的切割方向分析

5．3．8 HCDLase降解荧光标记CS四糖分析

5．4 本章小结

参考文献

第六章 新型内切型糖胺聚糖硫酸酯酶的酶学性质分析

6．1 材料与试剂

6．1．1 材料

6．1．2 试剂

6．2．1 重组蛋白底物专一性分析

6．2．2 最适反应条件分析

6．2．3 重组蛋白4-O-Endosulfatase的多糖降解特征

6．2．4 重组蛋白的酶活测定

6．3 结果与分析

6．3．1 底物特异性分析特性

6．3．2 最适反应特性分析

6．3．3 硫酸酯酶4-O-Endosulfatase多糖降解特性

6．4 本章小结

参考文献

第七章 新型糖胺聚糖工具酶的应用及相互作用

7．1 材料与试剂

7．1．1 材料

7．1．2 试剂

7．2 实验方法

7．2．1 高正电荷绿色荧光蛋白的表达纯化

7．2．2 内切型4-O-Endosulfatase对糖胺聚糖与蛋白结合作用的影响

7．2．3 HCDLase在CS六糖及八糖测序中的应用

7．2．5 内切型4-O-Endosulfatase与HCLase的协同作用分析

7．3 结果与分析

7．3．1 高正电荷绿色荧光蛋白的表达纯化

7．3．2 内切型4-O-Endosulfatase对于糖胺聚糖与蛋白结合作用的影响

7．3．3 HCDLase在CS六糖及八糖测序中的应用

7．3．4 内切型4-O-Endosulfatase与HCLase的协同作用分析

7．4 本章小结

参考文献

第八章 全文总结与展望

8．1 主要结果与意义

8．2 本论文的创新点

8．3 展望

致谢

攻读博士学位期间参与的项目

获奖情况

发表论文

国家发明专利