木质纤维素微生物降解酶系的探究与优化

摘要

为了提高来自里氏木霉的纤维素酶降解木质纤维素的效率，我们在里氏木霉和毕赤酵母中使用异源表达技术表达并构建了复合型酶系。来自Clostridiumstercorarium的耐热纤维素内切酶Cel9a和经过热稳定性改造的里氏木霉胞内β-葡萄糖苷酶Cel1b-S在里氏木霉中分别使用XYNⅡ和CBHⅠ的启动子和信号肽序列进行了表达分泌。Cel1b-S同样在毕赤酵母GS115中得到了异源表达，经镍柱纯化后与里氏木霉纤维素酶混合，并以微晶纤维素和脱木素玉米芯等木质纤维素作为底物进行了糖化水解测试，对其纤维素降解能力进行了高效液相色谱(HPLC)测定。
　　为了更深层次的理解丝状真菌降解木质纤维素的机理，我们尝试对里氏木霉的胞外纤维素酶多聚体进行了纯化。我们使用凝胶过滤色谱(GFC)、疏水作用色谱(HIC)及离子交换色谱(IEC)对分离浓缩后的里氏木霉T1胞外蛋白进行纯化，并对经过纯化后的蛋白样品进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN PAGE)进行检测。我们将在接下来的工作中尝试使用冷冻电镜(Cryo-EM)对多聚体结构进行解析。

目录

声明

摘要

符号说明

1．1 总论

1．2 里氏木霉中的木质纤维素酶

1．3 里氏木霉和毕赤酵母的异源蛋白表达

1．4 与木质纤维素降解相关的蛋白及其作用

1．5 蛋白质复合体的研究策略

1．6 里氏木霉胞外蛋白质复合体的发现

1．7 蛋白质的纯化策略

1．7．1 凝胶过滤层析

1．7．2 离子交换层析

1．7．3 疏水作用层析

1．7．4 亲和层析

1．8 冷冻电镜技术对蛋白复合体的结构探究

第二章 木质纤维素降解酶系的优化

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 所用质粒与菌株

2．2．2 PCR扩增及引物设计

2．2．3 RED／ET技术重组质粒方法

2．2．4 细菌质粒提取方法

2．2．5 里氏木霉与毕赤酵母基因组提取方法

2．2．6 里氏木霉原生质体转化及筛选方法

2．2．7 木质纤维素降解相关酶活测定方法

2．2．8 毕赤酵母LiCl转化及筛选方法

2．2．9 Ni-NTA蛋白纯化方法

2．2．10 木质纤维素糖化实验方法

2．2．11 HPLC检测糖化产物方法

2．2．12 本章实验所需试剂配制方法

2．2．13 微生物保藏方法

2．3 结果与分析讨论

2．3．1 重组质粒的构建

2．3．2 里氏木霉与毕赤酵母转化结果

2．3．3 蛋白表达结果

2．3．4 糖化水解实验结果

2．4 本章小结

第三章 木质纤维素酶多聚体的纯化

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 里氏木霉酶液培养方法

3．2．2 里氏木霉酶液浓缩方法

3．2．3 Lowry蛋白质含量测定方法

3．2．4 蛋白胶内酶解及质谱预处理方法

3．2．5 分子排阻色谱纯化方法

3．2．6 离子交换色谱纯化方法

3．2．7 疏水作用色谱纯化方法

3．2．8 蛋白样品脱盐方法

3．2．9 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN PAGE)检测方法

3．2．10 本章实验所需试剂配制方法

3．3 结果与分析讨论

3．3．1 多聚体重现性质谱鉴定结果

3．3．2 分子排阻色谱纯化结果

3．3．3 离子交换色谱纯化结果

3．3．4 疏水作用色谱纯化结果

3．3．5 冷冻电镜的多聚体结构初探

3．4 本章小结

全文总结与展望

附录

参考文献

致谢

攻读学位期间参加科研情况