pH敏感逐级靶向纳米载体的构建及其用于递送siRNA至M2型肿瘤相关巨噬细胞的研究

摘要

肿瘤免疫治疗是指激发或调动机体的免疫系统，增强机体抗肿瘤免疫应答，从而控制和杀伤肿瘤免疫细胞，抑制肿瘤生长[1-3]。近年来，肿瘤免疫疗法已发展成为继手术治疗、放射治疗、化学疗法之后的第四种肿瘤治疗模式。大多数实体瘤微环境中都伴有肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)，它们与肿瘤的生成、发展和转移密切相关。TAMs可以分为M1和M2两种表型。M1型TAMs可引起炎症反应、激活免疫反应，具有肿瘤抑制作用。M2型TAMs具有抗炎作用，且可促进血管生成和组织重塑，抑制免疫反应，促进肿瘤的生成、发展及转移。
　　由于肿瘤细胞分泌白介素-10、集落刺激因子(Colony Stimulating Factor，CSF-1)、转化生长因子β（Transforming-Growth Factorβ，TGFβ）等，肿瘤部位大多数TAMs表现为M2表型。杀伤M2型TAMs或促进M2型TAMs向M1表型的转化成为基于M2型TAMs肿瘤免疫治疗的有效手段。M2型TAMs成为肿瘤免疫治疗的有效靶点。目前作用于M2型TAMs的药物主要有单抗、小分子抑制剂和siRNA。其中，siRNA可以选择性沉默靶基因，对基因进行高度、特异性的调控，且具有特异性调节巨噬细胞和细胞内信号转导通路的潜能，可作用于M2型TAMs，发挥免疫疗效。
　　目前，一些研究构建树状大分子、阳离子聚合物、胶束等载体用于siRNA的递送，这些载体将M2型TAMs的靶向因子修饰于载体表面，从而发挥主动靶向作用。但是由于巨噬细胞分布范围广，将siRNA递送至其他正常组织的M2型巨噬细胞，可能会引起免疫系统破坏等毒副作用。因此，设计一种载体以增加siRNA在M2型TAMs的积累，减少siRNA在正常组织的分布，具有十分重要的意义。本课题构建pH敏感逐级靶向纳米载体通过组织透过性增强及滞留效应（enhanced permeation and retention effect，EPR effect）和转胞吞作用的双重一级靶向作用，到达肿瘤组织，增加纳米载体在肿瘤部位的蓄积;pH敏感一级靶向材料在肿瘤部位脱落，暴露二级靶向内核，靶向M2型TAMs，将siRNA特异性递送至M2型TAMs。
　　本课题选择靶向肽天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(asparagines-glycine-arginine，NGR)作为一级靶向因子，羧甲基壳聚糖（O-carboxymethyl-chitosan，CMCS）作为pH敏感材料，以聚乙二醇[poly(ethylene glycol),PEG]为连接，合成pH敏感一级靶向材料CMCS-PEG-NGR(CPN);选取甘露糖作为二级靶向因子，聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)作为基因压缩材料，合成α-D吡喃甘露糖基苯基异硫氰酸酯（α-D-Mannopyranosylphenyl，MPITC）-PEI(M-PEI)作为二级靶向材料。M-PEI压缩siRNA形成表面荷正电的二级靶向内核M-PEI/siRNA(MPR)，通过静电作用吸附在生理条件下(pH7.4)荷负电的CPN，构成pH敏感逐级靶向纳米载体CPN/M-PEI/siRNA(CMPR)。本课题选取siR-RiboTMNegative Control作为模型基因制备PEI/siRNA(PR)、MPR、CPN/PEI/siRNA(CPR)和CMPR，筛选处方并对最优处方进行理化性质评价，考察其稳定性、细胞摄取及分布，对CPN的pH敏感性进行验证，考察MPR、CMPR的体内靶向性，对PR、MPR、CPR、CMPR的体内安全性进行初步评价。主要研究方法和结果包括:
　　第一章一级靶向纳米载体的构建及其理化性质研究
　　本章合成pH敏感一级靶向材料CPN，以siR-RiboTM Negative Control为模型基因，采用室温孵育的方法制备PR及CPR。采用琼脂糖凝胶电泳对PEI压缩siRNA的能力及CPN静电吸附形成CPR的情况进行考察，确定最优处方;采用透射电镜观察PR、CPR的形态，Malvern粒度电位分析仪测定其粒径、粒度分布及电位;最后采用琼脂糖凝胶电泳对PR、CPR抗RNase A能力及血清稳定性进行考察。
　　实验结果表明，CPN的核磁共振氢谱(Nuclear Magnetic Resonance，1H NMR)出现CMCS、PEG、NGR特征峰，确证CPN的成功合成;PR的最优处方为PEI与siRNA质量比为2∶1，CPR最优处方为CPN与siRNA质量比为4∶1，最优处方工艺制备的PR和CPR形态较为圆整，均成球形或类球形，平均粒径分别为83.7±4.9 nm和154.5±2.1 nm，平均电位分别为20.97±1.53 mV和-14.10±0.90 mV，多分散系数均小于0.2;在12 h内，PR、CPR对siRNA具有一定的保护能力，可以保护siRNA免受RNaseA的降解及血清成分的破坏。
　　第二章pH敏感逐级靶向纳米载体的构建及其理化性质研究
　　本章合成二级靶向材料M-PEI，以siR-RiboTM Negative Control为模型基因，采用室温孵育的方法制备MPR及CMPR。采用琼脂糖凝胶电泳对M-PEI压缩siRNA的能力及CPN静电吸附形成CMPR的情况进行考察，确定最优处方;采用透射电镜观察MPR、CMPR的形态，Malvern粒度电位分析仪测定其粒径、粒度分布及电位;采用琼脂糖凝胶电泳对MPR、CMPR抗RNase A能力及血清稳定性进行考察;采用Malvern粒度电位分析仪对MPR、CMPR的存储稳定性及血浆稳定性进行考察;建立siRNA在不同pH PBS中的测定方法，采用动态膜透析法对siRNA的释放行为进行考察;采用酸碱滴定法测定CPN的等电点。
　　实验结果表明，M-PEI的1H NMR图谱出现MPITC、PEI的特征峰，确证M-PEI成功合成，傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR)进一步验证M-PEI的合成;MPR的最优处方为M-PEI与siRNA质量比为2∶1，CMPR最优处方为CPN与siRNA质量比为4∶1，最优处方工艺制备的MPR和CMPR形态较为圆整，均成球形或类球形，平均粒径分别为93.2±4.1 nm和146.4±6.9 nm，平均电位分别为16.40±0.92 mV和-17.00±0.10 mV，多分散系数均在0.2左右;在12h内，MPR、CMPR对siRNA具有一定的保护能力，可以保护siRNA免受RNaseA的降解及血清成分的破坏，在血浆中CMPR比MPR具有更高的稳定性;体外释放结果显示在pH5.0和pH6.5条件下 siRNA从CMPR中的累计释放量显著高于pH7.4条件，siRNA从CMPR中的释放具有一定的pH敏感性;CPN的等电点为6.33。
　　第三章pH敏感逐级靶向纳米载体的体内、外靶向性评价及初步安全性评价
　　本章以F4/80抗体标记巨噬细胞，以CD206抗体标记M2型TAMs，以Cy3和Cy5标记的siR-RiboTM Negative Control作为模型基因，对PR及MPR的细胞摄取进行考察。采用激光共聚焦显微镜对PR、MPR在小鼠腹腔巨噬细胞上的摄取进行观察和定量，对siRNA及CD206进行共定位及定量分析;对MPR在小鼠腹腔巨噬细胞上的竞争性摄取进行观察和定量分析;对CMPR在pH6.5、pH7.4培养基条件下的摄取进行观察和定量分析;采用小鼠活体成像的方法对CMPR在小鼠的体内分布进行观察和定量分析;采用免疫荧光技术观察小鼠肿瘤组织冰冻切片，对PR、MPR、CMPR在肿瘤组织中的细胞摄取情况进行考察;采用溶血实验对PR、MPR、CPR、CMPR的溶血情况进行考察;最后对给药小鼠组织进行HE染色评价PR、MPR、CPR和CMPR的初步安全性。
　　细胞摄取实验结果显示，细胞与PR、MPR孵育1h、4h后，M2型TAMs对PR、MPR的摄取无明显差异(p＞0.1);竞争性抑制实验结果显示，在未经游离甘露糖孵育的细胞内，细胞与MPR孵育1h后，siRNA与CD206的共定位效率为事先与游离甘露糖孵育细胞中共定位效率的1.63倍，存在一定差异(p＜0.05)，表明MPR可通过M2型TAMs表面CD206受体介导的内吞途径入胞，细胞与MPR孵育4h后，二者共定位效率无明显差异(p＞0.3);在pH6.5条件下，siRNA与CD206共定位效率为pH7.4条件下的1.40倍，存在显著差异(p＜0.01)，表明CPN可在pH6.5条件下响应性脱落;小鼠活体成像结果显示，CMPR组在肿瘤组织的平均荧光强度是游离siRNA组的4.65倍，表明CMPR可增加siRNA在肿瘤组织的蓄积;肿瘤组织冰冻切片实验结果表明CMPR可增加siRNA在M2型TAMs中的蓄积，MPR可特异性靶向M2型TAMs;溶血实验结果显示，PR、MPR、CPR、CMPR均不会引起溶血现象，可静脉注射;小鼠给予PR、MPR、CPR、CMPR后，对小鼠组织进行HE染色观察发现，各组织器官与生理盐水组比较无显著差异，无明显病理变化。上述实验结果表明，CMPR可增加siRNA在肿瘤组织的蓄积，CPN可在肿瘤组织微酸性条件下响应性脱落，MPR可通过M2型TAMs表面CD206受体介导的内吞途径入胞。PR、MPR、CPR、CMPR具有良好的初步安全性。
　　本课题以CPN作为pH敏感一级靶向材料，M-PEI作为二级靶向材料，构建pH敏感型逐级靶向纳米载体CMPR。CMPR可通过一级靶向增加载体在肿瘤组织的蓄积，通过二级靶向增强M2型TAMs中siRNA的蓄积。CMPR具有良好的稳定性和初步安全性，具有进一步开发的巨大潜力，为开发siRNA向M2型TAMs的递送载体提供了新思路、新方法。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

一、肿瘤免疫疗法

二、基于M2型TAMs的肿瘤免疫疗法

三、载体的选择

四、课题设计

第一章 一级靶向纳米载体的构建及其理化性质研究

一、仪器与试剂

1．试剂

2．仪器

3．溶液配制

二、实验方法

1．CPN的合成与表征

2．PR的制备

3．CPR的制备

4．处方考察

5．最优处方的理化性质评价

6．初步稳定性考察

三、实验结果

1．CPN的合成与表征

2．PR的制备

3．CPR的制备

4．最优处方的确定及其理化性质评价

5．初步稳定性考察

四、讨论

五、本章小结

第二章：pH敏感逐级靶向纳米载体的构建及其理化性质研究

一、仪器与试剂

1．试剂

2．仪器

3．溶液配制

二、实验方法

1．M-PEI的合成与表征

2．MPR的制备

3．CMPR的制备

4．处方考察

5．最优处方的确定及其理化性质评价

6．初步稳定性考察

7．RNA含量测定方法的建立

8．体外释放实验

9．CPN等电点的测定

三、实验结果

1．M-PEI的合成与表征

2．MPR的制备

3．CMPR的制备

4．最优处方的确定及其理化性质评价

5．初步稳定性考察

6．RNA含量测定方法的建立

7．体外释放实验

8．CPN等电点的测定

四、讨论

五、本章小结

第三章：pH敏感逐级靶向纳米载体的体内、外靶向性评价及其初步安全性评价

一、仪器与试剂

1．试剂

2．仪器

3．溶液配制

二、实验方法

2．竞争性抑制实验

3．CPN pH敏感响应性脱落实验

4．小鼠活体成像实验

5．肿瘤组织冰冻切片实验

6．红细胞溶血实验

7．组织切片实验

三、实验结果

1．PR及MPR细胞摄取实验

2．竞争性抑制实验

3．CPN pH敏感响应性脱落实验

4．小鼠活体成像实验

5．肿瘤组织冰冻切片实验

6．红细胞溶血实验

7．组织切片实验

四、讨论

五、本章小结

全文总结与展望

一、全文结论

二、创新点

三、展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文