EFEMP2在骨肉瘤侵袭转移和血管生成中作用机制的研究

摘要

骨肉瘤(Osteosarcoma)是当前阶段临床上较为常见的一种恶性肿瘤。放射治疗以及截肢是1970年之前该症最为主要的治疗方法，肺癌转移率非常高，5年生存率不足20％。随着手术切除治疗方案的广泛应用，以及多药联合化疗的大规模推广，该症的5年生存率总体水平提升非常明显。但是我们必须认识到，虽然化疗在该症的临床治疗过程中已经发挥了可喜的作用，并得到了更为广泛的关注和重视，但是整体化疗有效率始终限制在60％上下。
　　含表皮生长因子结构域的Fibulin样胞外基质蛋白2(EFEMP2，在部分文献资料中也同样被又称fibulin-4，MBP1，UPH1）。临床上发现其功能主要包括促进相关组织的形成和稳定。目前研究发现fibulin家族成员参与调解细胞生长、形态以及运动的一系列过程，并在临床数据统计中表现出和肿瘤因子的显著关联。EFEMP2在多种肿瘤发挥着不同的功能，它在肿瘤中的表达关系到肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移和血管生成，目前为止对其在骨肉瘤发生发展的作用尚不清楚。本研究拟观测EFEMP2对骨肉瘤细胞生物学行为的影响、其潜在的关联性和可能的分子机制，为骨肉瘤的检测和治疗提供新策略。
　　研究目的:
　　1.探讨EFEMP2在骨肉瘤组织中的表达，与患者预后的相关性，及其临床意义;
　　2.探讨EFEMP2对骨肉瘤侵袭、迁移能力的影响;
　　3.探讨EFEMP2在骨肉瘤细胞中对上皮间充质转化的影响;
　　4.探讨EFEMP2影响骨肉瘤细胞侵袭和迁移的相关信号通路。
　　研究材料和方法:
　　一、EFEMP2在骨肉瘤细胞生物学行为中的表达及相关性研究
　　1.免疫组织化学
　　选取自2005年至2015年间收集自山东大学齐鲁医院和山东省立医院骨科就诊的骨肉瘤病例石蜡组织标本共计160例，骨纤维结构不良标本60例,瘤旁正常组织40例，所有骨肉瘤病例均无术前的放射及化学治疗，常规随访。免疫组织化学检测的石蜡包埋切片首先在二甲苯中脱蜡，并在乙醇中再水化，然后在添入0.01M柠檬酸盐的PH为6.0缓冲液的高压锅内恢复;当达到压力时，切片在高压锅内孵化3分钟。免疫细胞化学中，细胞被接种于盖有载玻片的含有75％-80％混合液的培养皿中，24小时后收集盖玻片，PBS清洗三次，在95％的乙醇中处理30分钟。按照Streptavidin-Peroxidase Detection Kit(ZSGB-BIO)，接下来的步骤对于免疫组织化学检测和免疫细胞化学检测是相同的。
　　2.软琼脂克隆形成实验
　　用20％FBS培养基1.5ml与1.2％琼脂1.5ml混合加载至3.5cm培养皿，并凝固为底层;0.7％琼脂1.5ml混合20％FBS培养基1.5ml及200μl(MG63、U-2OS及hFOB)细胞悬液（含600个细胞）立即加入培养皿上层;所有的培养皿在37℃、5％CO2饱和适度下孵育2周，实验每个重复一式三份。在倒置显微镜(Nikon Eclipse)下，培养皿分为各个象限，对每个象限内的直径2mm以上的集落进行计数和平均数;所有数据用均数±标准误表示。、
　　3.细胞侵袭实验
　　被覆PVPF的Boyden小室(MA)加入50μl1∶3滴度的无血清Matrigel胶。上室内加入200μl（含2×105个细胞）的(MG63、U-2OS及hFOB)细胞悬液，下室内加入600μl无血清的上清NIH3T3细胞作为趋化因子，Boyden小室在37℃下孵育24小时。移除上表面基膜内非侵袭性细胞，下表面细胞以4％多聚甲醛固定，苏木精伊红染色，于倒置显微镜下随机5个高倍视野内计数。每个重复一式三份，所有数据用均数±标准误表示。
　　4.细胞迁移实验
　　细胞迁移实验同时按照上述步骤进行，不需Matrigel基膜，只孵育12小时。每个重复一式三份，所有数据用均数±标准误表示。
　　5.免疫细胞化学实验
　　各细胞被接种于盖有载玻片的含有75％-80％混合液的培养皿中，24小时后收集盖玻片，PBS清洗三次，在95％的乙醇中处理30分钟;余步骤同免疫组织化学实验。
　　二、EFEMP2在骨肉瘤细胞侵袭及转移能力的研究
　　1.单细胞克隆技术分离MG63细胞亚克隆株
　　取对数期生长的MG63细胞稀释至10个/ml，并以0.1ml/孔接种于96孔板，尽可能使之每孔内一个细胞，添加培养液至0.2ml/孔，在37℃、5％CO2孵化箱一周后，收集生长良好的每个孔内的单克隆细胞，依次移至24孔和6孔培养板，最后移至培养瓶中扩大培养。在细胞电泳设备(DY-100)中，分别测定各亚克隆细胞的迁移率。最终获得31株单克隆细胞亚系，编号为MG63-1～MG63-31。
　　2.细胞电泳率的测定
　　取克隆的31株细胞，常规培养至汇合状态，对其进行离心处理后去除上清液，通过滴加1％蔗糖溶液重悬获得单细胞悬液，利用光电显微镜对其活细胞数量进行统计，调整细胞密度至1×106/ml，加入细胞电泳仪。计数12～16个瘤细胞/株，在电场中自动泳动250μm正向和反向各一次所需时间，根据公式计算细胞电泳速度。根据电泳结果，MG63-1细胞株速度最快，MG63-31细胞株最慢。
　　3.生长曲线
　　各个细胞亚系收集于对数增长期，接种于24孔板（1×104个细胞/孔），在37℃、5％CO2孵育;每日在三个孔内加入胰酶消化，收集活细胞，并计数和均数;细胞倍增时间按照patterson公式计算，连续7天按照细胞计数和均数标绘生长曲线。结果显示MG63-1克隆株的生长最快，MG63-31最慢。
　　4.慢病毒转染
　　pLVX-EFEMP2慢病毒载体和EFEMP2shRNA慢病毒载体以及阴性对照，均由GeneChem Inc.获得。根据载体的说明，优先将病毒感染的靶细胞接种于24孔板，每孔细胞数0.5×105，于37℃、CO2孵化箱孵育24或48小时，至60-80％的细胞汇合;然后通过加入病毒库将细胞感染，多重感染指数(MOI)达到100。另外，也包括阴性对照的病毒构建转导孔。细胞在37℃、5％CO2条件下孵育整晚，转染混合物放置在正常培养基内，避免细胞毒作用。48小时后，细胞通过荧光显微镜检查进行评估;转染效率由蛋白免疫印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应法和免疫细胞化学法确认。EFEMP2的siRNA序列是:sense5'-CAGAUCCGUGCUGGAAACUCG-3'和antisense3'-AGUUUCCAGCACGGAUCUGAA-5'。阴性对照（杂乱次序）是:sense5'-AUCGACGAUCCCUAUUGGCGU-3'和antisense3'-GCCAAUAGGGAUCGUCGAUCU-5'。
　　三、EFEMP2通过PI3K-AKT-mTOR信号途径诱导上皮间质转化在促进骨肉瘤侵袭及转移的作用及机制研究
　　1.实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)
　　实验方法同前。
　　2.Western blot实验
　　实验方法同前。
　　统计学分析
　　免疫组化检测数据使用x2检验。双侧t检验用于比较两组的均数比较，三组均数间的比较使用单边方差分析。Kaplan-Meier检验、秩和检验和生存曲线分析用于EFEMP2与骨肉瘤病例预后之间的相关性分析。所有数据使用SPSS13.0软件分析，以P＜0.05（双侧）认为具有统计学差异。
　　研究结果:
　　1.EFEMP2在入骨肉瘤组织内表达
　　我们发现在人骨肉瘤组织内EFEMP2蛋白高表达，而在大多数的正常组织内EFEMP2的免疫反应性很低;而且，EFEMP2高表达肯定与低分化类型和淋巴结转移相关。在qRT-PCR实验中，发现骨肉瘤组织中的EFEMP2mRNA高表达与肿瘤的低分化和淋巴结转移同样具有相关性。利用Kaplan-Meier检验的生存曲线分析表明，骨肉瘤中EFEMP2高表达的病例的不良预后要高于低表达者。
　　2.高侵袭及低侵袭亚克隆细胞株的建立
　　使用单细胞克隆技术，从MG63细胞中亚克隆出31株;相对于MG63-31亚克隆细胞株的低迁移率(7.68±0.13μm/s)，MG63-1亚克隆细胞株据有更高的迁移率(19.59±0.56μm/s)，并表现出更高的增殖力和侵袭能力。在体内，高侵袭亚克隆组的皮下肿瘤形成率为100％，并伴有肿瘤的迅速生长;而低侵袭组的皮下肿瘤形成率只有大约50％，生长速度亦缓慢。MG63-1组的肿瘤体积为479.82±34.31mm3，要显著大于MG63-31组的瘤体体积(35.91±3.73mm3，P＜0.01)。
　　3.人骨肉瘤细胞系与正常成骨细胞系的不同增殖和侵袭力
　　与正常成骨细胞系hFOB相比，人骨肉瘤细胞系U-2OS和MG63表现出更强的增殖能力;在软琼脂克隆形成实验中，细胞系U-2OS和MG63所形成的克隆数也显著的高于细胞系hFOB;在细胞迁移实验和Matrigel侵袭实验中，细胞系U-2OS和MG63的迁移和侵入均数都高于细胞系hFOB。在两个骨肉瘤细胞系中，MG63组的增殖能力和侵袭力要强于U-2OS组。
　　结论:
　　1.EFEMP2在骨肉瘤组织中呈阳性表达，并与不良预后正相关
　　2.EFEMP2在体内外试验中均促进骨肉瘤细胞的侵袭及转移
　　3.EFEMP2通过PI3K-AKT-mTOR信号途径诱导上皮间质转化。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 EFEMP2在骨肉瘤细胞生物学行为中的表达及相关性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第二部分 EFEMP2在骨肉瘤侵袭及转移能力的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第三部分 EFEMP2通过PI3K-AKT-mTOR信号途径诱导上皮间质转化在促进骨肉瘤侵袭及转移的作用及机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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