血管内皮生长因子(VEGF)在胃癌发展过程中通过JNK信号通路调节组蛋白去甲基化酶RBP2表达

摘要

目的:
　　胃癌是中国乃至全世界最常见的恶性肿瘤之一，在胃癌的发展过程中，遗传和表观遗传的改变可以导致癌症的渐进转化。本文研究人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)对组蛋白去甲基化酶RBP2的调控机制，从而探索VEGF在癌症发展过程中的新机制，明确这一新的分子机制对胃癌诊断和治疗的潜在作用。
　　方法:
　　1.在组织水平上，用实时定量PCR和免疫组织化学的方法检测15对标本（胃癌组织和癌旁正常组织）中VEGF和RBP2的水平，通过比较VEGF和RBP2在胃癌和癌旁组织中的表达水平，初步探索两者之间的相关性。
　　2.在分子水平上，通过人重组VEGF蛋白(rhVEGF)和VEGF小干扰RNA处理胃癌细胞系，从mRNA水平和蛋白水平检测VEGF对RBP2表达的影响。之后加入rhVEGF，利用特异的VEGF下游信号通路抑制剂检测RBP2以及JNK信号通路的表达情况。通过功能性回复实验研究VEGF通过JNK信号通路调节RBP2表达的可能性。
　　3.在动物水平，裸鼠皮下注射VEGF稳定干扰和加入rhVEGF的胃癌细胞系BGC-823，实时监测肿瘤的形成和体积变化，15天后麻醉处死，分离瘤组织，通过免疫组化以及qPCR的方法检测RBP2的表达情况。
　　结果:
　　1.与正常组织相比，胃癌组织中VEGF和RBP2均表达升高，并且VEGF和RBP2的表达具有正相关性。
　　2.加入rhVEGF诱导的胃癌细胞系中RBP2表达升高。抑制胃癌细胞系中VEGF的表达，RBP2表达则相应降低。进而，使用VEGF下游信号通路的特异性信号通路抑制剂，发现JNK通路在VEGF诱导RBP2的表达中起重要作用。Western blot的结果显示加入VEGF诱导的胃癌细胞系中JNK蛋白的磷酸化以及下游关键分子P53的表达均降低。
　　3.通过QRT-PCR和Western blot证实，即使是在干扰RBP2的表达后，加入rhVEGF仍然可以部分回复RBP2的表达。克隆形成实验和细胞侵袭迁移实验证明VEGF可以部分回复因为干扰RBP2而引起细胞增殖和侵袭能力降低的效应。
　　4.在裸鼠实验中也证实了VEGF的作用。将裸鼠分为对照组、VEGF沉默表达以及rhVEGF三组，证明了VEGF在肿瘤生长的作用。同时QRT-PCR和免疫组织化学实验同样显示出在体内的VEGF和RBP2的正相关性。
　　结论:
　　VEGF在胃癌的发展过程中，可以通过JNK信号通路调节组蛋白去甲基化酶RPB2的表达，该研究阐释了VEGF的一个新机制，进一步确定了其在胃癌发生发展中的重要的作用，为其作为药物靶点提供了更好的理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

实验材料

1．胃组织临床标本

2．实验用裸鼠

3．细胞系及细胞培养试剂

6．逆转录PCR(RT-PCR)试剂

11。蛋白质印迹法(Western Blot)试剂

12．免疫组织化学和Western blot抗体

13．人重组VEGF蛋白(rhVEGF)

14．VEGF信号通路抑制剂

15．实验用常见仪器

实验方法

1．临床标本的采集和处理

2．免疫组织化学染色

3．胃癌细胞培养、传代和铺板

4。临床标本、胃癌细胞系及裸鼠移植瘤RNA的提取

5．RNA的逆转录反应

6．实时定量PCR

7．胃癌细胞系总蛋白的提取

8．蛋白质印迹法(Western Blot)测定蛋白的表达

9．胃癌细胞系侵袭实验

10．胃癌细胞系克隆形成实验

11。裸鼠皮下成瘤实验

12．统计学分析

实验结果

1．在人体胃癌组织中VEGF和RBP2的表达水平呈正相关性

3．VEGF通过JNK细胞信号通路调控RBP2表达

4．在干扰RBP2后，胃癌上皮细胞的克隆形成能力和侵袭能力降低；加入rhVEGF可以部分回复胃癌上皮细胞的克隆形成能力和侵袭能力

5．在动物实验水平，我们用裸鼠皮下成瘤实验进一步证实VEGF可以正调控RBP2表达进而影响肿瘤生长

讨论

结论

附表

参考文献

致谢

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