中重度RA患者他克莫司治疗前后外周血T亚群和Galectin-9的变化研究

摘要

目的：
　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以关节滑膜炎为的慢性自身免疫性疾病。其特征是对称性、侵袭性的多关节炎症，可以导致关节畸形及功能丧失。RA的治疗策略主要是减轻关节炎症，防止不可逆的骨质破坏，达到病情完全缓解或降低疾病活动度。
　　他克莫司(tacrolimus，TAC、FK506)是一种钙调神经磷酸酶抑制剂，可以特异性降低神经钙调磷酸酶(CN)活性以抑制T细胞增殖，并通过抑制白细胞介素2(Interleukin2，IL-2)的释放，全面抑制T淋巴细胞活化和分泌细胞因子。目前已有多篇报道证实了TAC治疗RA的有效性和安全性，可以短时间内有效控制病情，尤其是重度RA患者，从而减少关节毁损，改善患者生活质量。
　　半乳凝集糖-9（Galectin-9，Gal-9）是内皮细胞分泌的哺乳动物凝集素，可以趋化嗜酸性粒细胞、癌细胞和免疫细胞，发挥着调节免疫、增殖等多种作用。Gal-9是T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin domain and mucin-3，Tim-3)的配体，二者结合后可以下调IFN-γ的表达，诱导CD4+T细胞凋亡，有研究发现，RA患者滑膜组织和滑膜液中存在Gal高表达[1]，Gal-9可以通过阻止肿瘤坏死因子（TNF-α）和IL-1的产生或通过免疫复合物激活巨噬细胞产生IL-10抑制关节炎的发生[2]，因此认为Gal-9在RA发病中是负性调节因子。但这一观点不断受到对Gal-9功能新研究结果的质疑，近年发现Gal-9的C端和N端CRD与Tim-3的结合方式和亲和力不同，Gal-9-N端可以激活浆样树突细胞(DC)[3]、增强NK细胞毒作用并诱导TNF-α产生而启动天然免疫。血管内皮细胞(EC)表达Gal-9，但文献报道Gal-9不同的剪接变异体对EC细胞生物学的作用不一，可能受Gal-9胞内定位、浓度和细胞环境影响[4]。这表明Gal-9可以通过不同浓度不同途径方式促进先天免疫、调节适应性免疫和细胞增殖。
　　目前在临床上，对Gal-9在RA患者外周血中的表达和变化规律研究报道不多。本研究旨在观察使用TAC特异性改变中重度RA患者T细胞功能前后患者的病情活动度、外周血T细胞亚群和Gal-9表达的变化规律及相关关系，进一步明确Gal-9与RA病情活动度的相关性，验证Gal-9作为RA病情变化的生物学标记作用，及Gal-9参与RA免疫炎症和血管生成的机制。
　　方法：
　　收集山东大学齐鲁医院风湿科门诊和病房中重度RA患者治疗前77例，治疗后58例，其中治疗前后自身对照33例。根据根据入组原因分为反应不佳组(NR组)和不耐受组(NT组)，有关节外表现组（WG组）和无关节外表现组(NG组)，根据治疗方案是否联合MTX和激素，分为联合MTX组(WM组)和不联合MTX组(NM组)，联合激素组（WP组）和不联合激素组(NP组)，所有入组患者均随访至12周(w)，分别收集RA患者性别、年龄，基线(0w)及12w外周血WBC计数、淋巴细胞比率、血沉(ESR)和C反应蛋白(CRP)数值，关节疼痛数(T28)和肿胀数(SW28)，记录患者健康评价调查表(HAQ)，病人总体评分(PGA)及医生对患者的病情评估(PHGA)，分别计算患者疾病活动度指标，即DAS28-ESR、DAS28-CRP、SDAI、CDAI。同时收集我院体检中心健康体检者同年龄性别匹配的健康体检者58例，作为健康对照组（HD组）。
　　流式细胞术方法检测外周T细胞亚群即CD4+、CD8+、CD4+CD8+(Doublepositive T cell,DPT)、CD4-CD8-(Double negative T cell,DNT)以及CD3+CD4+CD25+CD127low标记的调节性T细胞（Regulatory T cells，Treg），单核细胞(CD14+)，分别测定各亚群的百分数及亚群上Gal-9的表达水平。采用酶联免疫吸附测定技术(ELISA)检测血浆中Gal-9、VEGF、IL-2、IL-6、TNG-α的表达水平，并使用SPSS22.0软件进行相关统计分析。
　　结果：
　　1.所有入组患者规律使用TAC12w后的炎症指标、疾病活动度指标与基线相比均显著下降（P＜0.01），;
　　2.流式分析发现33例RA患者外周血Treg细胞占CD4+的百分比基线值较HD组升高，治疗12w后下降(P＜0.01);
　　3.ELISA结果显示33例RA患者血浆中Gal-9、IL-6、TNF-α、VEGF等细胞因子的基线值水平均较HD组均有明显升高(P＜0.01)，而治疗后RA患者血浆Gal-9的水平降低(P＜0.05)。
　　4.对TAC治疗前77例、治疗后58例RA患者进行各自时点的相关性分析，并对33例自身对照RA患者进行治疗前后各指标的分析发现，77例治疗前、58例治疗后和33例治疗后RA患者血浆中的Gal-9和CDAI、DAS28-CRP均具有正相关关系;Treg占CD4+T细胞亚群的比例和多个T亚群上Gal-9的表达有正相关关系，77例治疗前、58例治疗后和33例治疗前后外周血Treg与DPT+Gal均具有正相关关系;对治疗后58例RA患者相关分析发现，血浆中Gal-9和各个T亚群上Gal-9均具有正相关关系。
　　结论：
　　1.他克莫司治疗RA是有效的，所有RA患者规律治疗后临床症状、炎症指标及疾病活动度指标均有明显下降。
　　2.33例RA患者治疗前Treg占CD4+T细胞亚群的比例较HD组上升，表明RA病情活动度时Treg免疫调控也增加;治疗后Treg比例下降则提示TAC免疫抑制、病情活动度下降后Treg的负调节作用也减弱平息。
　　3.RA患者血浆中Gal-9在治疗前较HD组明显升高，治疗后显著下降，且下降水平与疾病活动度正相关，提示Gal-9的反映疾病活动度的敏感指标，可以作为RA新的生物标记物。
　　4.RA治疗前后时点，分别进行相关分析中均发现，Treg和多个T亚群Gal+具有正相关关系，且二者在治疗前后同向下降，提示Gal-9与T细胞亚群数目及功能密切相关，尤其是Treg的比率和功能，是其参与RA免疫调控的一个重要途径。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

资料与方法

一、资料

2．33例RA患者治疗前后变化及与健康对照(HD组)的差异

3．33例RA患者各亚组不同指标之间的差异

4．所有入组RA患者临床及实验室指标的相关分析

讨论

结论

附图表

参考文献

致谢