GATA4-NF-κB通路在结肠癌细胞适应酸性微环境中的作用及机制研究

摘要

恶性肿瘤危害着人类的生命健康。其中实体瘤在恶性肿瘤中所占比重很大（约85％以上），而实体瘤的瘤体内普遍存在微环境异常。肿瘤细胞糖代谢偏向糖酵解，且由于实体瘤内血管化程度差、血流灌注相对不足，不能满足肿瘤细胞高代谢的氧需求，造成细胞外的H+无法及时清除，乳酸在局部堆积，造成局部酸性微环境。对于正常细胞，细胞外酸性微环境是有害的，然而肿瘤的发生发展及其恶性程度均依赖于细胞外酸性环境，并受其多重影响。研究发现用酸性培养基培养的肿瘤细胞可发生突变，且细胞外酸性环境更易诱导肿瘤细胞发生侵袭和转移。研究者用低pH(6.7)培养基短期培养乳腺癌细胞，细胞增殖率降低，G1期发生停滞，自噬水平明显增加。课题组前期工作显示，长期用低pH(6.5)培养基培养结肠癌细胞（3个月及以上）获得的适应酸性环境的结肠癌细胞(CRC-AA)，发生EMT、增殖率下降、G1期停滞、凋亡水平降低、自噬升高和ROS降低等变化。
　　我们的实验结果提示低水平的ROS对于结肠癌细胞适应酸性环境极其重要。但自噬并不参与维持CRC-AA细胞ROS低水平。但是一方面自噬底物p62可正调控抗氧化应激调控因子NRF2;另一方面自噬底物p62可以负调控GATA4-NF-κB通路。同时，NRF2与核转录因子NF-κB之间存在拮抗作用。那么CRC-AA细胞中ROS低水平是否与NRF2功能有关？NF-κB是否可能发挥抗氧化作用帮助结肠癌细胞适应酸性环境？基于上述问题，开展了一系列工作并取得以下结果:
　　1.适应酸性微环境的结肠癌细胞中NRF2表达下调，不参与维持ROS低水平采用Western Blotting方法检测pH(7.4)培养的结肠癌细胞(CRC)和CRC-AA细胞中NRF2蛋白表达水平。与CRC细胞相比，CRC-AA细胞中NRF2表达水平显著下调。用ATG5siRNA干扰CRC和CRC-AA细胞，Western Blotting方法检测NRF2以及p62蛋白表达水平，结果表明CRC-AA细胞中抑制自噬，p62表达上调，NRF2表达未上调。
　　2.适应酸性微环境的结肠癌细胞中NF-κB表达上调，维持结肠癌细胞在酸性微环境中的生存
　　采用免疫荧光实验研究CRC和CRC-AA细胞中p65分布情况。结果表明，与CRC细胞相比，CRC-AA细胞中p65主要分布在细胞核中。采用Western Blotting方法检测CRC和CRC-AA细胞中p-p65和p65蛋白表达水平。结果表明，在CRC-AA细胞中p-p65表达水平上调。之后采用实时荧光定量PCR方法检测CRC和CRC-AA细胞中代表性的炎症因子表达情况，结果表明:CRC-AA细胞中炎症因子表达明显高于对照细胞。通过平板克隆形成实验证明NF-κB抑制剂Bay11-7082可明显抑制CRC-AA细胞的克隆形成能力，而对照组差异不明显。在CRC和CRC-AA细胞中加入NF-κB抑制剂BAY11-7082或用p65siRNA干扰细胞，AnnexinⅤ-PI双染法处理细胞，用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示CRC-AA细胞凋亡比例显著高于CRC细胞。这些结果提示与CRC细胞相比，CRC-AA细胞更依赖NF-κB介导的促生存功能。
　　3.NF-κB对适应酸性微环境的结肠癌细胞的保护作用依赖其抗氧化功能用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理CRC和CRC-AA细胞，采用流式细胞术检测ROS水平。结果表明:加NF-κB抑制剂处理后的细胞中ROS水平升高。之后，用p65siRNA干扰CRC和CRC-AA细胞，流式细胞术检测ROS水平，结果表明:p65siRNA处理的细胞中ROS水平升高。采用抗氧化剂NAC（10mM）预处理CRC和CRC-AA细胞，然后p65siRNA干扰细胞，经AnnexinⅤ-PI双染法处理细胞后，流式细胞术检测发现NAC可明显拯救抑制NF-κB功能引起的细胞凋亡。同时，包括SOD和SOD2在内的代表性抗氧化基因在CRC-AA细胞中的上调可被BAY11-7082抑制。这些结果提示NF-κB对CRC-AA细胞的保护作用由其抗氧化功能介导。
　　4.适应酸性微环境的结肠癌细胞中GATA4表达上调，影响结肠癌细胞在酸性微环境中的生存
　　采用Western Blotting检测CRC和CRC-AA细胞中GATA4表达水平，结果表明:CRC-AA细胞中GATA4表达明显上调。采用实时荧光定量PCR方法检测GATA4siRNA干扰CRC和CRC-AA细胞，代表性的炎症因子表达情况，结果表明:CRC-AA细胞中抑制GATA4功能，炎症因子表达水平降低。用siRNA干扰CRC和CRC-AA细胞GATA4表达，流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明:CRC-AA细胞中siGATA4后，细胞凋亡比例明显升高，而CRC细胞变化不大。用GATA4siRNA干扰CRC和CRC-AA细胞，流式细胞术检测ROS水平。结果表明:GATA4siRNA处理的细胞中ROS水平升高。采用抗氧化剂NAC(10mM)预处理CRC和CRC-AA细胞，然后GATA4siRNA干扰细胞，经AnnexinⅤ-PI双染法处理细胞后，流式细胞术检测发现NAC可明显拯救抑制GATA4功能引起的细胞凋亡。
　　5.适应细胞外酸性微环境的结肠癌细胞的分泌保护作用
　　通过平板克隆实验初步探究适应细胞外酸性微环境的结肠癌细胞分泌可溶性因子帮助结肠癌细胞适应酸性环境，结果显示:加入CRC-AA细胞上清液后，CRC细胞在酸性培养基中克隆能力明显高于对照细胞。
　　总之，我们的工作表明GATA4-NF-κB通路在CRC-AA细胞中上调，并且对CRC-AA的存活至关重要，其促生存效应依赖于其抗氧化功能。另外，NF-κB介导的可溶性因子的产生也可能有助于促进CRC-AA细胞生存效应。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料和方法

结果

2．适应酸性微环境的结肠癌细胞中NF-κB表达上调，影响结肠癌细胞在酸性微环境中的生存

3．NF-κB对适应酸性微环境的结肠癌细胞的保护作用依赖其抗氧化功能

4．适应酸性微环境的结肠癌细胞中GATA4表达上调，影响结肠癌细胞在酸性微环境中的生存

5．适应细胞外酸性微环境的结肠癌细胞分泌可溶性因子帮助结肠癌细胞适应酸性环境

讨论

小结

参考文献

致谢

硕士期间参与发表的论文