白色念珠菌ARE2基因功能及两种天然产物的抗真菌机制研究

摘要

近年来，以念珠菌为主的真菌感染威胁着人类的健康，特别是免疫缺陷群体。临床用于治疗真菌感染的药物包括唑类、多烯类和棘白霉素类。有限的抗真菌药物种类以及耐药的广泛出现使得世界范围内的真菌感染发生率逐年增加，真菌感染治疗依然面临着严峻的挑战。因此，寻找新型抗真菌感染策略以及开发新型抗真菌药物具有重要意义。
　　白色念珠菌作为一种机会致病菌在正常条件下能与人和平共处，当宿主免疫力低下或菌群失衡时能爆发性生长并造成宿主感染。白色念珠菌引起宿主感染的重要原因是其毒力因子的存在，抑制真菌毒力可以降低白色念珠菌的感染能力。因此，抑制真菌毒力可作为一种有效的抗真菌策略。
　　文献报道，酿酒酵母细胞中，Are蛋白具有甾醇酰基转移酶活性，areΔ/Δ菌株表现为甾醇酯合成减少，脂泡体积减小。前期研究发现白色念珠菌ARE2基因敲除后，脂泡体积未明显变化，提示我们ARE2基因在白色念珠菌中存在新功能。研究发现，白色念珠菌are2Δ/Δ菌株角鲨烯大量累积，造成白色念珠菌细胞膜表面的甾醇含量比例发生较大改变。甾醇组份的改变，易引起细胞膜流动性及通透性发生变化，进而影响细胞的多种生理过程和正常生长状态。并且，真菌细胞膜在调控氧化应激、药物耐药和真菌毒力方面发挥着重要作用，细胞膜结构变化易造成胞内氧化失衡，压力应激能力降低等。基于上述理论，我们评价了are2Δ/Δ菌株的细胞膜流动性、胞内氧化状态及压力应激能力等。通过DPH染色检测细胞膜流动性，发现are2Δ/Δ菌株细胞膜流动性降低。通过DCFHDA染色检测胞内ROS含量，发现are2Δ/Δ菌株胞内ROS累积，并且抗氧化剂GSH含量下降，表明敲除菌株胞内氧化还原失衡。通过微量稀释法和平板稀释法检测敲除菌株的压力应激能力，发现are2Δ/Δ敲除菌对多种环境压力因子敏感性显著提高，包括高温(45℃)、氧化剂(H2O2)、细胞壁压力因子（SDS、Congo red、荧光钙白）及抗真菌药物（两性霉素B、卡泊芬净、氟康唑）等。综上，are2Δ/Δ菌株甾醇组份的改变使得细胞膜流动性降低，导致胞内氧化还原失衡且压力应激能力降低。
　　are2Δ/Δ敲除菌株对细胞壁压力因子的敏感度增加提示我们are2Δ/Δ敲除菌的细胞壁完整性可能被破坏。采用透射电子显微镜(TEM)观察细胞形态，发现are2Δ/Δ敲除菌与野生菌株相比，细胞壁厚度减小。细胞壁成分由内向外依次为几丁质(chitin)、葡聚糖(glucans)及廿露聚糖(mannan)。通过ConA-FITC染料对细胞壁mannan成分染色，发现are2Δ/Δ菌株中mannan含量减少。提取白色念珠菌mannan并进行GPC分析，发现are2Δ/Δ敲除菌与野生菌相比，其mannan平均分子量减小，说明ARE2基因参与mannan合成通路的调控。通常，mannan含量的降低会引起β-glucan的暴露增加。通过采用β-(1，3)-glucan抗体染色，发现白色念珠菌Are2失活后，导致β-glucan的暴露增加。白色念珠菌的β-glucan可被巨噬细胞、中性粒细胞等固有免疫细胞表面识别受体Dectin-1识别，激活机体免疫反应，快速清除病原菌。因而ARE2可调控mannan合成引起β-glucan暴露，降低白色念珠菌毒力。
　　细胞膜与白色念珠菌两相性转变密切相关，麦角甾醇合成通路的变化影响白色念珠菌的菌丝形成能力。文献报道，抑制白色念珠菌ERG1基因表达，会导致角鲨烯累积，菌丝形成能力缺陷。因此，are2Δ/Δ菌株甾醇组份及细胞膜流动性的改变提示我们其菌丝形成能力可能受到影响。研究发现，抑制白色念珠菌ARE2基因表达，会造成角鲨烯累积，并表现出较弱的菌丝形成能力。进一步研究表明，敲除菌株中甾醇中间体之一的法尼醇（一种群体感应分子）累积，法尼醇合成增多能够抑制腺苷酸环化酶Cdc35的活性，降低cAMP的合成，进而调控Ras1-cAMP-Efg1通路，抑制白色念珠菌两相性转变。荧光定量PCR结果显示Efg1下游粘附相关基因（如ALS3、HWP1、ECE1）表达量下降，并且are2Δ/Δ菌株在生物及非生物介质表面表现了较弱的黏附能力。此外，菌丝形成是白色念珠菌侵袭及成熟被膜形成的重要条件，are2Δ/Δ菌株较弱的菌丝形成能力使其表现出较弱的侵袭及被膜形成能力。通过显微镜和扫描电镜观察发现，are2Δ/Δ敲除菌株无法形成正常的被膜结构。并且，与野生菌株相比，are2Δ/Δ敲除菌株形成的被膜对AMB的敏感性明显增强，这意味着are2Δ/Δ敲除菌株形成的被膜更容易被清除。综上，ARE2基因可通过调控甾醇合成，调控白色念珠菌菌丝及被膜形成，进而调控其毒力。
　　基于ARE2基因三方面的功能，即调控胞内氧化还原状态、调控mannan合成影响β-glucan的暴露以及调控白色念珠菌的两相性转变，提示are2Δ/Δ敲除菌具有低的真菌毒力。采用小鼠系统性感染模型进行体内实验发现，are2Δ/Δ敲除菌株的致病能力显著下降。are2Δ/Δ敲除菌感染小鼠的生存率明显高于野生菌株感染的小鼠。通过肾组织病理切片染色（PAS染色、HE染色）及肾脏中细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ）的检测发现，感染敲除菌株的小鼠与野生菌株感染小鼠相比，肾脏荷菌量低、损伤程度轻。
　　本论文首次证明抑制白色念珠菌ARE2基因的表达，可造成甾醇合成通路紊乱、胞内氧化失衡及细胞壁合成受损等，并且，are2Δ/Δ敲除菌还表现出弱的菌丝形成能力、粘附侵袭能力及被膜形成能力等。因此，Are2可作为一个重要的靶点进行抗真菌毒力小分子的筛选及设计。
　　天然产物长久以来是重要的新药发现来源之一，从1981年至2014年间，FDA批准的一半新药直接或间接来自于天然产物。一些临床上用于治疗真菌感染的药物也来自于天然产物，如两性霉素B和卡泊芬净。地衣是真菌和藻类的共生体，具有食药两用价值。本课题组长期致力于地衣内生真菌次生代谢产物的提取分离，已分离得到多种结构类型的抗真菌活性化合物。本论文对从地衣内生真菌Biatriospora sp.中得到的庚聚酮类化合物Biatriosporin D(BD)及从Floricola striata中分离的三联苯类化合物Floricolin C(FC)进行了较深入的抗真菌作用机制研究。
　　白色念珠菌可因生长环境不同表现出酵母和菌丝两种形态，菌丝与酵母态相比具有更强的侵袭和组织浸润能力，并且，菌丝是被膜形成必不可少的条件，而被膜形成加重了耐药和复发性感染的发生。前期研究发现，BD具有较好的抗真菌活性，MIC80为8-16μg/ml，并且可以逆转唑类耐药菌的耐药性。在研究中，我们发现BD能够通过抑制粘附、菌丝形成和被膜形成，降低白色念珠菌的毒力。值得注意的是，BD可在1/4-MIC的剂量下发挥菌丝抑制作用。进一步研究发现，BD可以延长被真菌感染的线虫寿命，展示出一定的体内抗真菌应用潜力。机制研究证明，BD通过上调DPP3基因表达，促进法尼醇分泌，降低cAMP含量，进而调控Ras-cAMP-PKA信号通路，抑制菌丝形成。该研究揭示了BD抗真菌毒力的作用机制，为抗真菌感染提供了一个有潜力的靶向真菌毒力的化合物。
　　本课题组前期研究发现，FC可以通过破坏细胞膜发挥抗真菌作用。本研究发现FC可以直接刺激线粒体诱导胞内活性氧(ROS)的累积;也可以通过其α，β-不饱和酮结构与胞内巯基物质发生Michael加成反应，破坏含巯基的分子(GSH)或蛋白功能，导致胞内氧化失衡。较高的氧化状态会进一步破坏线粒体的功能，造成线粒体膜电势升高，ATP水平增加并诱导细胞色素c(Cyt c)释放。此外，ROS还能造成胞内大分子的破坏，以及诱导细胞凋亡。实验发现，低剂量的FC可以诱导细胞发生凋亡，而高剂量的FC可诱导细胞坏死。进一步研究发现，FC还可以抑制白色念珠菌的被膜形成以及清除成熟被膜，并对其他念珠菌属也表现出强的抗真菌活性。体内实验发现FC能够提高被念珠菌感染的线虫存活率，展示出了一定的体内抗真菌潜力。
　　本论文详细论述了ARE2基因在白色念珠菌致病过程中的作用，为开发靶向抑制Are2的抗真菌剂提供了理论基础，为克服真菌感染提供了新思路。对两个天然小分子BD和FC抗真菌机制的研究为开发新型抗真菌剂奠定了理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

1．1 临床念珠菌感染现状

1．2 真菌致病因素

1．3 细胞膜脂质成分与毒力的关系

1．4 抗真菌药物

1．5 抗真菌策略

1．6 天然产物与抗真菌药物

参考文献

第二章 ARE2基因敲除菌株的构建

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

参考文献

第三章 ARE2在维持真菌胞内氧化状态及细胞壁合成过程中的作用

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

参考文献

第四章 ARE2调控白色念珠菌的两相性转变及被膜形成

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

参考文献

第五章 天然产物Biatriosporin D抗真菌毒力机制研究

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．3 实验结果

5．4 讨论

参考文献

第六章 天然产物Floricolin C的杀菌机制研究

6．1 实验材料

6．2 实验方法

6．3 实验结果

6．4 讨论

参考文献

致谢

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