高脂摄入增加大鼠睾丸支持细胞糖酵解和乳酸合成

摘要

近几十年来，全球范围内男性的生育能力呈现出显著下降的趋势。大量临床流行病学和动物实验研究发现，高脂摄入与男性生育能力呈显著负性相关。精子质量下降是男性不育的最主要原因之一。精子形成过程错综复杂，是多种睾丸细胞复杂而精细的相互作用结果。其中睾丸支持细胞，作为生精细胞的“保姆”细胞，在精子的发生发展过程中发挥十分重要的作用。支持细胞为生精细胞提供物理和免疫屏障、依附支撑、营养支持等作用。支持细胞为生精细胞提供多种营养物质和代谢产物（碳水化合物，氨基酸，脂质等）作其能量来源，其中乳酸尤为重要。乳酸不仅是发育中的生精细胞的主要能源底物，同时还可以保护生精细胞，减少生精细胞的凋亡。研究表明，2，4-二氯苯氧乙酸和双酚A等一些化学物质可以通过抑制支持细胞乳酸的产生，降低精子质量，进而损伤雄性生育能力。另有研究发现支持细胞可以通过增加乳酸生成，从而减少由热应激引起的生精细胞的凋亡。目前研究发现，高脂饮食可以通过破坏支持细胞血睾屏障的完整性，影响精子密度和精子能动性，降低雄性生育能力。高脂饮食是否通过调控睾丸支持细胞营养代谢，影响精子质量，从而损伤雄性生育能力，目前尚不清楚。
　　目的:
　　探讨高脂饮食是否通过调节睾丸支持细胞糖代谢进而影响男性生育能力，以及导致支持细胞糖代谢变化的潜在机制。
　　方法:
　　3周雄性Wistar大鼠，适应性喂养1周后，随机分为两组:分别给予普通饲料（普食组）和高甘油三酯饲料（高脂组）喂养，建立高脂摄入大鼠模型。每周称量体重，饲养8周后（即鼠龄12周），按1∶2的比例与12周Wistar雌鼠合笼5天，评估两组雌鼠怀孕率和幼崽数目。处死雄鼠，(1)采用全自动生化分析仪检测血清甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)，低密度脂蛋白(LDL-C)，高密度脂蛋白(HDL-C)及血糖水平。(2)计算机辅助精子质量分析检测附睾尾的精子数目、精子密度，精子活力，精子能动性等指标。(3)利用HE染色、电镜观察:睾丸及支持细胞的大体形态及超微结构变化，利用油红0染色观察睾丸内脂质沉积情况。(4)利用乳酸检测试剂盒测定睾丸组织乳酸水平的变化。
　　从19-20天的Wistar雄鼠睾丸获取原代支持细胞，免疫荧光检测支持细胞核特异性表达WT1蛋白进行细胞纯度鉴定，CCK8筛选棕榈酸处理浓度及时间。给予0、0.25、0.50mmol/L棕榈酸处理24h后，观察:(1)油红0评估支持细胞的脂质含量。(2)GOD-POD法评估葡萄糖消耗情况;试剂盒测定支持细胞乳酸合成和分泌情况和细胞内丙酮酸及丙酮酸其他代谢产物水平。(3)利用细胞能量分析仪检测棕榈酸对支持细胞糖酵解及乳酸合成的影响。(4)利用Western blot检测糖代谢关键指标的蛋白表达。
　　结果:
　　1.高脂饮食的大鼠体重增加，血脂升高;大鼠的精子密度下降(P＜0.05)，配对雌鼠平均每窝产仔数下降达40％(12.33±0.33vs7.33±1.20，P＜0.05);
　　2.高脂摄入导致睾丸生精上皮变薄紊乱，支持细胞胞浆中空泡数量的增加，电镜观察支持细胞发现高脂摄入大鼠支持细胞的正常线粒体数目减少，同时自噬线粒体数目增加，支持细胞超微结构异常;
　　3.高脂饮食大鼠的生精小管和支持细胞内出现显著的脂质沉积，棕榈酸刺激的支持细胞内脂质沉积也显著多，棕榈酸0.50mmol/L组细胞比0.25mmol/L组细胞更加明显;
　　4.高脂增加支持细胞糖酵解水平，促进乳酸合成。高脂饮食大鼠睾丸组织乳酸水平显著高于普通饮食大鼠(32.97±1.119vs37.60±1.391，P＜0.05);棕榈酸处理后的支持细胞分泌到培养基中的乳酸明显增加，尤其是在0.50mmol/L棕榈酸处理的细胞中(10.03±0.37vs16.61±1.27，P＜0.01);
　　5.棕榈酸处理支持细胞后，葡萄糖转运蛋白1表达没有明显变化，而棕榈酸0.50mmol/L组的支持细胞葡萄糖转运蛋白3表达增加(对照组的1.38±0.14倍，P＜0.05);细胞内乳酸脱氢酶蛋白质表达和活性没有明显变化，但棕榈酸0.50mmol/L组的细胞培养基中乳酸脱氢酶活性显着增加(33.17±4.15vs56.36±1.88，P＜0.05);单羧酸转运体4蛋白表达增加(P＜0.05)。
　　结论:
　　高脂饮食促进睾丸支持细胞糖酵解和乳酸合成，可能是在高脂条件下支持细胞维持生精细胞正常发育的一种保护性的行为。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．高脂摄入与男性精子质量下降密切相关

2．睾丸支持细胞对正常精子生成意义重大

3．支持细胞合成的乳酸对生精细胞生存发育非常关键

4．过量摄入脂肪酸在不同细胞中对乳酸的产生影响不同

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法及步骤

三、统计学处理

结果

1．高脂摄入降低雄性大鼠的精子质量和生育能力

2．高脂摄入导致睾丸生精小管内脂质沉积，结构改变及支持细胞的超微结构异常

3．支持细胞能够摄取游离脂肪酸并随时间积聚在细胞内

4．高脂促进支持细胞乳酸合成

5．棕榈酸通过促进支持细胞糖酵解增加乳酸合成

6．棕榈酸促进支持细胞的葡萄糖消耗和乳酸转运

讨论

结论

参考文献

课题的创新点与局限性

致谢

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