microRNA-145在肾母细胞瘤中的表达及其对肾母细胞瘤细胞生物学行为调控的研究

摘要

目的：
　　肾母细胞瘤(Wilms'Tumor，WT)是最常见的儿童泌尿系恶性实体肿瘤，WT约占儿童肿瘤的6％，在小于15岁的儿童及青少年中的发病率为0.1‰。microRNAs(miRNAs)是长约18-25nt的非编码RNA，这些小RNA几乎可以涉及整个生命活动，其对细胞的增殖分化、周期调控、细胞凋亡及自噬的调控作用受到越来越多的关注。目前已经证实参与蛋白处理的miRNA突变在肾母细胞瘤发病过程中起到关键作用。microRNA-145(miR-145)为miRNA家族中的重要成员，其在多种肿瘤，如胃癌、结直肠癌、食管癌、乳腺癌及前列腺癌等中呈低表达。研究认为miR-145作为一种抑癌基因在肝内胆管癌、膀胱癌等多种肿瘤中可以通过PI3K/Akt信号通路影响肿瘤细胞的各种生物学行为，包括细胞的生长、侵袭迁移能力，但其在WT中的作用仍不清楚。该研究旨在探讨miR-145在肾母细胞瘤中的表达情况及与临床病理参数的关系，过表达miR-145后对肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞中PI3K/Akt信号通路的调控作用，进而影响肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡、自噬及迁移能力。
　　材料和方法：
　　收集32例肾母细胞瘤患者的肿瘤组织及相应癌旁正常组织标本，利用qRT-PCR检测肿瘤组织及癌旁正常组织中miR-145的相对表达量。在体外培养肾母细胞瘤S K-NEP-1细胞，qRT-PCR检测SK-NEP-1细胞中miR-145的表达水平，与人肾胚上皮细胞(293T)相比较。通过miR-145慢病毒载体过表达肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞中miR-145的表达水平，将其分为空白对照组、空载病毒转染组、miR-145过表达组及miR-145+Akt-stimulate(Akt-s)组。利用荧光显微镜观察细胞中荧光蛋白的表达情况，通过qRT-PCR检测过表达肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞后miR-145的表达水平。利用CCK-8细胞增殖实验观察miR-145对肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞增殖的抑制作用。流式细胞技术检测肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞过表达miR-145后早期凋亡比例的变化。AO/EB荧光染色检测细胞死亡情况。Transwell实验检测miR-145对肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞迁移能力的影响。Western blotting检测过表达miR-145后PI3K/Akt信号通路相关蛋白(PI3K，Akt及p-Akt)的表达水平，检测过表达miR-145后凋亡相关蛋白(Bax，Bcl-2，caspase)的变化，检测过表达miR-145后自噬相关蛋白(p62，LC3B及Beclin1)表达水平变化。
　　结果：
　　一、miR-145在肾母细胞瘤临床标本中表达水平的研究
　　与相应的癌旁正常组织（相对表达量为22.75±3.78）相比，肾母细胞瘤组织（相对表达量为3.41±1.56）中的miR-145水平显著减低，两者表达的差异有统计学意义(P＜0.05)。miR-145表达水平与临床分期有明显相关性，临床Ⅰ期患儿的肿瘤标本中miR-145表达水平高于临床Ⅱ、Ⅲ期的患儿，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　二、miR-145在肾母细胞瘤细胞中的表达水平及其对Akt信号通路的调控
　　转染miR-145慢病毒前，检测miR-145在人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞中的相对表达量为(2.15±0.02)，明显低于人肾胚上皮细胞(293T)的相对表达量(57.23±1.78)，差异有统计学意义(P＜0.05)。荧光检测及qRT-PCR验证miR-145过表达组的相对表达量(1.17±0.07)较空白对照组中miR-145的相对表达量(12.6±0.24)增高。Western blotting结果显示在肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞中信号通路相关蛋白PI3K及p-Akt蛋白水平减低，提示PI3K/Akt信号通路受到抑制。
　　三、miR-145对肾母细胞瘤细胞生物学行为的调控
　　1.CCK-8细胞增殖实验结果显示，miR-145过表达组细胞的增殖速度较空白对照组及空载病毒转染组减慢，差异有统计学意义(P＜0.05)。Western blotting结果显示，miR-145过表达组中Ki67蛋白表达水平较空白对照组、空载病毒转染组减低。
　　2.流式细胞技术结果显示，miR-145过表达组细胞的凋亡率(1.87±0.06)较空白对照组凋亡率(0.17±0.04)增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。AO/EB荧光染色结果显示，miR-145过表达组细胞的死亡比例(19.36±3.14)％较空白对照组(4.69±4.79)％增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。Western blotting结果显示miR-145过表达后，自噬相关蛋白p62的表达减低、LC3B及Beclin1的表达水平增加，凋亡相关蛋白caspase-3表达及Bax/Bcl-2的比值增加。3.Transwell迁移实验结果显示，miR-145过表达组较空白对照组及空载病毒转染组的迁移能力减低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　四、Akt激活剂在miR-145对肾母细胞瘤细胞生物学行为调控中的作用在CCK-8、AO/EB荧光染色、Western blotting、Transwell迁移实验中，Akt激活剂(2μg/ml)可以部分恢复miR-145对肾母细胞瘤细胞的抑制作用。
　　结论：
　　miR-145在肾母细胞瘤肿瘤组织中表达下调，且与患儿临床分期相关。上调miR-145表达水平可以抑制PI3K/Akt信号通路，进而抑制肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞的增殖、迁移，同时上调了肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞的自噬和凋亡水平，促进肿瘤细胞的死亡，发挥了抑癌基因的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料和方法

3．主要实验仪器及耗材

4．主要实验试剂

5．实验方法

6．qRT-PCR法检测miR-145在肾母细胞瘤肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达

7．慢病毒转染

8．CCK-8细胞增殖实验

9．吖啶橙／溴化乙锭(AO／EB)荧光染色

10．Transwell细胞迁移实验

11．Western blotting检测凋亡、自噬及相关信号通路蛋白变化

12．流式细胞仪检测细胞凋亡

13．统计学分析

实验结果

4．miR-145可以抑制肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞的增殖

8．过表达miR-145可以调控PI3K／Akt信号通路的表达

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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