pH敏感载锰焦糖化碳纳米球在MR成像及光热治疗诊疗一体化的应用研究

摘要

在过去的几十年中，肿瘤已经成为全球威胁人类健康的首要问题。对肿瘤初始症状和确诊之间关系的评估，进一步影响制约了肿瘤进展和预后。近年来，随着纳米技术的发展，集生物医学成像诊断和治疗于一体且具有优化治疗效果并监测治疗效应的多功能纳米材料引起了广泛的研究关注，在医学领域肿瘤诊疗方面显示出了重要价值和发展潜力。
　　迄今为止，已经有多种成像模式被应用于纳米医学的研究，如磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)，光声成像(PA)，X线计算机断层扫描(CT)等。在不同的临床成像模式中，MRI是应用最广泛的成像和诊断技术之一。MRI较其他成像模式，具有高空间分辨率，非侵袭性，高结构对比度，显著的组织分辨力和无电离辐射的优势。因此，基于MRI的治疗诊断已经获得了广泛的关注，现已成为肿瘤诊断治疗的热点之一。目前，临床上最常用的含Gd对比剂(CAs)被认为与肾功能受损，超敏反应和肾性纤维化皮肤病(NFD)患者的肾性系统性纤维化(NSF)相关。由于Mn核外5个不成对电子具有较长弛豫时间，而被认为是可替代Gd CAs的最有前景的T1加权CAs。
　　探索不损害正常组织的治疗策略是肿瘤治疗所面临的巨大挑战。近年来利用近红外(NIR)光吸收剂产生热量并损伤肿瘤细胞而对正常细胞和组织不产生伤害的光热疗法(PTT)，由于其微创性和潜在有效性而引起越来越多的关注。与肿瘤传统治疗（手术，化疗和放疗）不同，PTT具有两种水平的选择性:被动/主动靶向肿瘤的光热剂和NIR光束直接聚焦在肿瘤部位。
　　因此，集MRI和PTT功能于一体的诊断治疗纳米粒的研制将为肿瘤的诊断治疗开辟新的发展前景。
　　基于此，本研究通过脱水和芳构化作用从葡萄糖制备碳质纳米球(CNSs)。然后，通过CNSs和MnCl2之间的氧化还原反应将Mn2+键合到其表面上以获得载锰焦糖化碳纳米球(Mn-CNSs)。其具备以下特征:1，Mn-CNSs可以作为近红外光吸收剂实现光热治疗;2，锰基对比剂作为一种MRT1对比剂已被广泛研究;3，Mn-CNSs的pH响应性使得其更易在酸性条件下释放Mn2+，从而具有pH响应的成像效果。
　　研究目的:
　　探究pH敏感载锰焦糖化碳纳米球(Mn-CNSs)的体内外MR成像、光热治疗作用以及体内分布、血液循环规律，以实现肿瘤诊疗一体化。
　　研究方法:
　　将无水葡萄糖(4g)溶于超纯水(35mL)中并搅拌均匀，然后将溶液转移至高压釜中加热，维持温度180℃，加热6小时。最后，通过离心（12000rpm，10分钟）分离获得棕色产物焦糖化碳纳米球(CNSs)，并将沉淀物用乙醇和水洗涤3次。干燥所得产物以备进一步使用。取制备好的少量干燥CNSs分散在50ml超纯水中，加入1g四水合氯化锰，超声20分钟，然后搅拌12小时。最后，用无水乙醇和水离心洗涤，在80℃烘箱中干燥4h以获得载锰焦糖化碳纳米球(Mn-CNSs)。通过透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和元素分析仪探究Mn-CNSs纳米粒的形态特征及元素构成特点。GE Signa HDX3.0T核磁共振扫描仪测试Mn-CNSs在不同pH下的MR弛豫率(r1)。通过CCK8法验证Mn-CNSs对细胞的毒性大小，H&E染色法评估Mn-CNSs对健康6-8周Balb/c小鼠的慢性毒性作用;利用TEM、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-MS)定性定量评估不同细胞对Mn-CNSs的摄取。通过Mn-CNSs纳米粒孵育MCF-7细胞（人乳腺癌细胞）后，用2W/cm2的808nm近红外激光(NIR)照射，探究其体外光热治疗作用。6～8周约20g左右的雌性荷瘤Balb/c小鼠，尾静脉注射Mn-CNSs(4mg Mn/Kg)后进行MR成像、用2W/cm2的808nm近红外激光照射肿瘤部位进行光热治疗研究。
　　研究结果:
　　1.SEM、TEM检测表明Mn-CNSs纳米粒呈球形结构，元素分析进一步证实了Mn-CNSs由锰(Mn)、氯(Cl)和碳(C)三种元素组成。
　　2.Mn-CNSs在pH=5.0体系的弛豫率(r1=5.42mM1S-1)较pH=7.4体系弛豫率（r1=0.18mM-1S-1）提高了近5倍，具有显著酸性pH响应。
　　3.CCK-8实验结果:在适当浓度范围内，Mn-CNSs对细胞的活力影响较小。200ppm的Mn-CNSs培养细胞48h后，细胞活力仍＞90％。H&E染色分析尾静脉给药健康Balb/c小鼠Mn-CNSs l天，7天，14天和28天后的各器官组织结构，未发现异常组织结构改变。
　　4.TEM、ICP-MS结果发现，摄取前后乳腺癌细胞(MCF-7)、巨噬细胞及正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）内的Mn2+含量依次为11.66±2.00和40.08±2.90，5.44±1.53和18.99±2.07，1.24±0.58和4.83±4.83fg/细胞。
　　5.体外光热治疗:通过Hochest/PI双染，流式细胞分析术发现光热治疗后的MCF-7的细胞凋亡、坏死率(21.69％)较对照组高(5.49％)（P＜0.05）。体内光热治疗，尾静脉注射组肿瘤部分温度升高29。℃，瘤内注射组升高32℃。光热治疗后的肿瘤H&E染色:光热治疗组的坏死较对照组严重。
　　6.尾静脉注射后进行体内MR成像研究，肿瘤部分强化近1.5倍，肝组织强化不明显。
　　研究结论:
　　载锰焦糖化碳纳米球(Mn-CNSs)集MR成像与光热治疗于一体，实现4T1荷瘤小鼠的诊疗一体化。具有高生物相容性、pH响应的特点，为未来肿瘤靶向和个性化精准治疗提供了新方法，是一个具有应用前景的多功能诊断治疗纳米体系。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

参考文献

第一部分 载锰焦糖化碳纳米球的合成、表征及体外性质测试

材料与方法

结果

讨论

小结

附图表

参考文献

第二部分 载锰焦糖化碳纳米球的体外摄取、光热治疗评估

材料与方法

结果

讨论

小结

附图表

参考文献

第三部分 载锰焦糖化碳纳米球的体内MR成像及光热治疗评估

材料与方法

结果

讨论

小结

附图表

参考文献

Mn基纳米粒在肿瘤诊断治疗学的研究进展

致谢

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