银屑病与麻风/糖尿病共有易感基因的发现和功能研究

摘要

感染性疾病的发病率逐渐下降，而免疫炎症性疾病和代谢性疾病的发病率正在稳步上升。这些复杂性疾病的发生都是由遗传因素作为内因和外界环境作为外因共同作用的结果。2005年以来，全基因组关联分析(Genome Wide Association Study，GWAS)的开展极大推动了复杂疾病分子遗传学研究的发展，目前多达3，000项GWAS研究发表。有趣的是，某些疾病存在共有易感基因，说明这些复杂疾病之间存在内在的遗传学关联:部分易感基因位点在免疫炎症性疾病及感染性疾病中发挥相反的效应;部分易感基因位点在免疫炎症性疾病和代谢性疾病中发挥协同的效应。本研究拟以免疫炎症性疾病银屑病和感染性疾病麻风为例寻找在这两种疾病中发挥拮抗作用的单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)，以免疫炎症性疾病银屑病和代谢性疾病糖尿病为例寻找它们共享易感位点，为阐明银屑病与麻风、银屑病与糖尿病之间的内在关联奠定基础。
　　银屑病和糖尿病均为慢性的免疫、炎症相关性疾病，流行病学、免疫学和遗传学研究均已表明银屑病和糖尿病之间存在密切的生物学关联。多个银屑病和糖尿病的易感基因相关研究发现在这两种疾病中存在共有的易感基因，例如:CDKAL1、PSORS2、PSORS3和PSORS4这4个银屑病的易感基因已经被发现也与2型糖尿病相关;PTPN22与1型糖尿病、关节病型银屑病及早发型银屑病都相关等。这些研究提示银屑病和糖尿病之间可能存在共同的遗传背景。这两种疾病的发生可能受到相同易感基因甚至相同的易感位点的影响，而这些相同的易感基因可能又通过参与相同的分子通路来影响银屑病或糖尿病的发生和发展。
　　虽然GWAS研究已经发现了这三种疾病大量的易感基因，但是这些研究均是围绕单个疾病展开，尽管我们通过这些研究可以总结分析到共同的易感基因，但很难精确到共同易感位点，并且既往的研究结果之间存在很强的种族遗传异质性，因此目前缺少将这些疾病的易感位点在一种人群中验证的系统性研究以进一步为银屑病与麻风/糖尿病之间的关系提供有力的遗传学证据。那么麻风和银屑病是否存在在一方疾病中起致病作用而在另一方疾病中起保护作用的易感位点？糖尿病和银屑病之间是否存在共有的致病易感位点？并探讨发现的部分易感位点是否是功能变异，又是如何调控相关靶基因的差异表达进而在疾病的发病机制中发挥重要作用。为研究这些问题，我们在中国北方汉族人群中进行以下研究:
　　第一章 银屑病与麻风共有易感位点的遗传关联性分析及功能研究
　　第一节 银屑病与麻风共有易感位点的遗传关联性分析
　　为从遗传学角度探讨银屑病与麻风之间关系，我们通过SEQUENOM MassArray全基因分型技术将23个中国汉族人群的麻风易感基因位点在3，312个中国北方汉族银屑病患者和3，312个正常对照者中进行验证，以期发现新的银屑病易感基因位点;将25个中国汉族人群的银屑病易感基因位点在3，312个中国北方汉族麻风患者和3，312个正常对照者中进行验证，以发现新的麻风易感基因位点。试图从遗传学角度寻找单核苷酸多态性在两种疾病中发挥的多效作用:在一者起到保护作用的同时而对另一种疾病发挥风险作用，以此更好地了解两种疾病之间关系。
　　我们发现麻风的易感位点rs1465788与银屑病相关(P=2.39×10-3，OR=1.13)，rs1465788_T(A)在麻风中发挥保护作用，而对银屑病起到风险作用。我们对银屑病病例组进行分层（≤16岁为早发型银屑病组;≥45岁为晚发型银屑病组），将它们与年龄、性别及地域均相匹配的健康对照相比较，发现rs1465788与早发型银屑病更相关(P=7.84×10-5，OR=1.21)。
　　研究结果表明rs1465788位点等位基因T(A)增加了银屑病的发生风险，而我们团队前期研究已证实rs1465788位点等位基因T(A)在麻风中发挥保护作用。我们发现了银屑病的新的易感基因位点rs1465788，同时也发现在银屑病和麻风中存在发挥着相反效应的SNP位点（相反的优势比），这为这两种疾病互斥假说提供了遗传学依据。
　　第二节 变异rs1465788通过影响ZFP36L1基因转录活性导致疾病易感的机制研究
　　通过中国北方汉族人群银屑病和麻风相关易感基因的研究，发现rs1465788位点等位基因T(A)增加了银屑病的发生风险，然而在麻风中发挥保护作用。这提示位于ZFP36L1区域的rs1465788位点在银屑病和麻风中发挥相反的生物学作用。rs1465788位点位于ZFP36L1基因转录方向的上游629bp，本节中我们进一步探讨了rs1465788位点是否能影响ZFP36L1基因的转录效率从而对疾病的发生产生影响。
　　我们采用实时定量PCR的方法检测了rs1465788位点不同基因型正常个体外周血的ZFP36L1基因的相对表达水平，因AA基因型个体较少，我们选取共30个携带GG纯合基因型、30个携带AG杂合基因型的个体进行实验，结果发现携带AG基因型组与携带GG基因型组相比ZFP36L1基因的相对表达水平虽有上升的趋势但它们之间的差异并没有统计学意义（P＞0.05）。我们通过HaploReg v4.1获知rs1465788位点位于ZFP36L1基因转录方向的上游区域，并通过Regulome DB预测rs1465788位点所在位置可能有转录因子CTCF、CREBBP和SIN3A的结合，这说明rs1465788位点可能位于基因ZFP36L1的启动子区域，并可能影响其转录表达效率。我们利用双萤光素酶实验研究了rs1465788不同等位基因对本区域启动子的转录活性的影响以及其影响是否与转录因子CTCF、CREBBP和S1N3A的结合有关。我们将ZFP36L1基因转录方向上游2.0kb的区域克隆到萤光素酶报告载体中，并分别与CTCF、SIN3A的转录因子的表达载体共转染293T细胞（CREBBP基因过长，未能成功构建其表达质粒）。实验结果发现携带等位基因A的片段的转录活性显著高于携带等位基因G位点的片段，差异具有统计学意义(P＜0.05);同时发现携带rs1465788等位基因A或G的片段的转录活性皆可因转录因子CTCF的加入显著提高(P＜0.05)，但CTCF对于rs1465788位点的两种等位基因的作用无特异性，而SIN3A的加入不能对rs1465788的转录活性产生显著的改变。
　　本节的研究通过双萤光素酶报告基因实验对rs1465788位点不同等位基因对ZFP36L1启动子区域的转录活性作用进行了研究，等位基因rs1465788_A的转录活性较等位基因rs1465788G的转录活性高，这可能导致了ZFP36L1基因的高表达。虽然双萤光素酶报告基因实验发现转录因子CTCF对ZFP36L1基因发挥正调控作用，但rs1465788不是通过影响其与CTCF结合而影响ZFP36L1基因启动子区域的转录活性。既往一项研究表明脂多糖刺激的小鼠巨噬细胞中Zfp3611的低表达可能会增加丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1（Mkp-1）的信使RNA的稳定性从而抑制p38有丝蛋白激活蛋白激酶(p38MAPK)的激活和肿瘤坏死因子(Tnf)-α的生成，影响到小鼠的免疫反应。结合该研究，我们推测rs1465788_G极可能导致ZFP36L1的低表达并进一步通过MKP-1-p38MAPK通路导致TNF-α的表达下调，参与麻风的发生;反之，rs1465788_A上调了TNF-α的表达从而参与了银屑病的发病和发展。双萤光素酶报告实验结果与第一节发现的银屑病的风险等位基因为rs1465788_A的结果是一致的。本节研究结果为rs1465788可能参与银屑病和麻风的发病机制提供了依据。
　　第二章 糖尿病与银屑病共有易感位点的遗传关联性分析
　　为了鉴定银屑病和糖尿病这两种疾病之间更多的共享易感基因位点以探索这两种疾病共有的发病机理，我们采用Sequenom平台对既往报道的糖尿病易感位点在山东地区的汉族人群中的4，456个银屑病患者和6，027个正常对照者中进行验证。健康对照组与病例组两组间年龄、性别及地域均相匹配。根据GWAS报道和易感位点之间连锁不平衡情况，我们选定了131个糖尿病易感位点进入本研究。105个易感位点通过引物设计，经过质量控制后，最终89个点被选入进行分析研究。
　　这89个糖尿病易感位点中我们发现了三个与中国汉族银屑病之间存在显著相关性的新的银屑病易感位点:rs6679677(P=6.15×10-5，OR=5.07)，rs16861329(P=2.02×10-4，OR=0.87)，rs849135(P=6.59×10-9，OR=1.78)，这三个位点分别位于PTPN22，ST6GAL1和JAZF1基因。我们还对这三个SNPs以及与这三个SNPs之间存在高度连锁不平衡(LD)(r2＞0.9，D'＞0.9)的SNPs进行了表达数量性状位点(eQTL)分析。我们发现rs6679677在全血中与PTPN22的表达有显著关联，rs849135在骨骼肌中与JAZF1的表达有关。然而我们并没有发现关于rs16861329的eQTL效应的任何证据。
　　研究结果发现银屑病和糖尿病之间确实存在共享的易感位点;另外位于PTPN22基因的SNP位点rs6679677与中国北方汉族人群银屑病显著相关，这提示T细胞受体信号通路在银屑病和糖尿病的发病机制中均发挥着重要作用，这也进一步证实了银屑病和糖尿病之间存在共享遗传易感性。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一章 银屑病与麻风共有易感位点的遗传关联性分析及功能研究

材料与方法

结果

讨论

附表

第二节 变异rs1465788通过影响ZFP36L1基因转录活性导致疾病易感的机制研究

材料与方法

结果

讨论

结论

第二章 银屑病与糖尿病共有易感位点的遗传关联性分析

材料与方法

结果

讨论

附表

结论

参考文献

致谢

博士在读期间发表的学术论文目录

外文论文1

外文论文2