泮托拉唑提高人口腔上皮癌KB/V耐药细胞对长春新碱的化疗敏感性及机制研究

摘要

研究目的:
　　口腔癌是一种不断增长的、严重威胁人类健康的全球恶性疾病。目前，临床上口腔癌常规的治疗方法主要有手术、放疗、化疗以及不同方法联合治疗。近年来，尽管在临床诊断及治疗方面都有了很大的进展，但口腔癌患者的五年生存率仍处于较低水平。长春新碱(Vincristine，VCR)，一种微管蛋白聚合抑制剂，是口腔癌治疗的基础化疗药物之一。与大多数抗肿瘤药物一样，多药耐药是限制VCR在临床应用的主要因素。质子泵抑制剂(Proton pump inhibitors，PPIs)，是通过降低胃壁细胞H+-K+-ATPase活性而抑制胃酸分泌的一类药物，近年来其抗肿瘤活性受到研究者的广泛关注，并且与化疗药物合用能够增强治疗效果，但其作用机制并不完全明确。PPIs安全性较好，本身具有抗肿瘤作用，在联用中可减小化疗药物剂量，降低毒性，还有临床实验报道PPIs联用镇吐剂可减轻化疗导致的胃肠道反应。在本论文中，我们从细胞和动物两个方面观察研究了质子泵抑制剂泮托拉唑(Pantoprazole，PPZ)与VCR合用对人口腔上皮癌KB/V耐药细胞的增殖、凋亡、周期、侵袭转移以及肿瘤组织生长的影响，并对其可能的作用机制进行了探讨。
　　研究方法：
　　1.检测PPZ预处理是否能增加VCR对KB及KB/V细胞的细胞毒性。本论文首先采用MTT方法观察PPZ对KB及KB/V细胞增殖的影响，筛选合用中PPZ的剂量。接着采用MTT方法和克隆形成实验观察PPZ预处理24h是否可增加VCR对KB及KB/V细胞的细胞毒性。同时，检测了PPZ与VCR合用对人正常组织细胞的毒性作用。
　　2.检测PPZ与VCR合用对KB/V细胞凋亡的影响。采用Hoechst33342核酸染色方法及AnnexinⅤ-FITC/PI双染实验检测PPZ预处理24h与VCR合用后KB/V细胞的凋亡变化，并采用Western blotting方法检测PPZ和VCR对凋亡相关蛋白表达水平的影响。
　　3.检测PPZ与VCR合用对KB/V细胞周期分布的影响。采用PI染色法检测PPZ预处理与VCR合用后KB/V细胞周期分布变化，进一步检测细胞周期调控蛋白表达水平的变化。
　　4.检测PPZ和VCR合用对KB/V细胞迁移和侵袭能力的影响。采用划痕实验和Transwell实验检测PPZ和VCR合用后KB/V细胞迁移和侵袭能力的变化，并采用Western blotting方法检测PPZ和VCR对KB/V细胞中MMPs表达的影响。
　　5.探讨PPZ增强KB/V细胞对VCR化疗敏感性的分子机制。
　　采用罗丹明123胞内蓄积实验和Western blotting方法检测PPZ和VCR合用对KB/V细胞中P-gp蛋白功能和表达的影响。
　　采用pH计检测在非缓冲体系中，不同浓度PPZ处理不同时间后KB/V细胞的上清培养基pH值作为胞外pH(pHe)值，并与Ⅴ-ATPase抑制剂Baf-A1的作用做对比，观察PPZ是否抑制KB/V细胞泌酸功能，并对PPZ处理后KB/V细胞的Ⅴ-ATPase表达水平进行检测。为了进一步检测PPZ对VCR细胞毒性的协同作用与Ⅴ-ATPase的关系，实验中采用MTT方法观察加入Baf-A1后对PPZ与VCR合用的协同生长抑制作用的影响。
　　通过Western blotting实验观察PPZ和VCR合用对KB/V细胞中EGFR/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控情况。
　　6.检测PPZ与VCR合用对体内KB/V细胞移植瘤的生长抑制作用
　　将KB/V细胞接种到裸鼠体内建立移植瘤模型，观察PPZ和VCR对移植瘤生长和重量的影响;检测PPZ预处理能否提高VCR的抗肿瘤疗效及对裸鼠体重和胃部组织形态的影响;检测PPZ预处理能否降低VCR治疗的毒副作用，采用Western blotting实验检测瘤体组织中凋亡相关蛋白的表达变化。
　　研究结果：
　　1.PPZ显著增强KB及KB/V细胞对VCR的敏感性。实验结果发现PPZ对VCR抗肿瘤生长的协同增强作用在KB/V细胞中更加突出，且对人正常细胞HUVECs，GES-1及HL-7702均无明显细胞毒作用。
　　2.PPZ和VCR联合应用可诱导KB/V细胞凋亡。两药合用可通过促进Caspase3和PARP裂解，上调Bax表达以及下调Bcl-xL和Bcl-2蛋白表达，从而诱导KB/V细胞线粒体通路相关的细胞凋亡。
　　3.PPZ与VCR合用促进KB/V细胞阻滞于G2/M期。细胞周期阻滞作用可能与上调p21及下调Cyclin B1，cdc2及p-cdc2的表达有关。
　　4.PPZ与VCR合用能通过下调MMP-2和MMP-9蛋白的表达，从而抑制KB/V细胞的侵袭和转移能力。
　　5.PPZ与VCR合用对药物外排蛋白P-gp的表达及外排功能都有抑制作用，其中主要是PPZ的作用。
　　6.PPZ处理后KB/V细胞的胞外pH没有明显升高，对Ⅴ-ATPase的表达无明显抑制作用，而且，Baf-A1的干预不仅增强了PPZ对KB/V细胞的生长抑制作用，也显著增强了PPZ与VCR合用对KB/V细胞的协同抑制作用。综合以上结果表明，在KB/V细胞中，PPZ可能并不是通过抑制Ⅴ-ATPase以减弱细胞泌酸功能而发挥抗肿瘤作用以及逆转耐药作用。
　　7.PPZ与VCR合用能够协同抑制KB/V细胞中的EGFR/MAPK和PI3K/Akt/mTOR通路。
　　8.体内实验证实，PPZ和VCR合用对KB/V移植瘤有明显的协同生长抑制作用，且PPZ能减轻VCR治疗中导致的毒副反应。
　　研究结论：
　　PPZ和VCR合用能够协同抑制KB/V细胞及移植瘤的生长增殖，诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞，抑制KB/V细胞的侵袭转移。进一步探讨其分子机制，PPZ和VCR的协同抗肿瘤作用可能与抑制P-gp的表达和外排活性，以及下调EGFR/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号通路有关，与PPZ的抑酸作用以及Ⅴ-ATPase的表达水平无关。
　　研究意义
　　PPZ有望成为一种新型肿瘤化疗佐剂，PPZ和VCR的联合应用将为口腔癌（尤其是针对VCR产生耐药性的口腔癌）的治疗提供一种有前景的治疗策略。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．1 P-gP与MDR

1．2 细胞凋亡与MDR

1．3 PI3K／Akt／mTOR信号通路与MDR

2．长春新碱在癌症治疗中的临床应用现状

3．质子泵抑制剂(PPIs)抗肿瘤作用的研究现状

3．1 PPIs简介

3．2 PPIs抗肿瘤作用的研究现状

4．本课题的主要研究内容

1．化合物

2．细胞株

3．实验动物

4．试剂

5．试剂配制

6．仪器设备

1．细胞培养

3．克隆形成抑制试验

4．Hoechst 33342染色实验

5．Annexin V-FITC／PI双染实验

6．细胞周期检测

7．划痕实验

8．Transwell侵袭与迁移实验

9．罗丹明123胞内蓄积实验

10．细胞外pH值检测

11．Western blotting实验

12．裸鼠移植瘤生长抑制实验

13．统计学数据分析

实验结果

1．PPZ对KB及KB／V细胞增殖的影响

2．PPZ增强VCR对KB及KB／V细胞的细胞毒作用

2．1 PPZ增强VCR对KB及KB／V细胞的体外生长抑制作用

2．2．PPZ增强VCR对KB及KB／V细胞的克隆形成抑制作用

2．3 PPZ与VCR合用对人正常细胞株的细胞毒作用

3．PPZ增强VCR诱导KB／V细胞凋亡的作用

3．1．Hoechst 33342染色法观察细胞核的形态学变化

3．2．Annexin V-FITC／PI双染法定量检测细胞凋亡率

3．3．PPZ与VCR合用对细胞凋亡相关蛋白的调节

4．PPZ与VCR合用对KB／V细胞周期分布的影响

4．1．PPZ显著增强了VCR诱导KB／V细胞发生G2／M期阻滞的作用

4．2．PPZ与VCR合用对细胞周期相关蛋白的调节

5．PPZ与VCR合用抑制KB／V细胞的侵袭转移

5．1 划痕实验检测PPZ与VCR合用对KB／V细胞迁移的抑制作用

5．2 Transwell实验检测PPZ与VCR合用对KB／V细胞迁移、侵袭的抑制作用

5．3 PPZ与VCR合用抑制KB／V细胞中MMP2和MMP9的表达

6．1．PPZ与VCR合用对KB／V细胞内P-gP外排功能的影响

6．2．PPZ与VCR合用对KB／V细胞中P-gp蛋白表达的影响

7．PPZ对KB／V细胞无明显抑酸作用

7．1 PPZ对KB／V细胞胞外pH无明显碱化作用

7．2 PPZ对KB／V细胞中V-ATPase蛋白表达无明显抑制作用

9．PPZ与VCR合用抑制KB／V细胞中的EGFR／MAPK和PI3K／Akt／mTOR信号通路

9．1 PPZ与VCR合用抑制KB／V细胞中的EGFR／MAPK信号通路

9．2 PPZ与VCR合用抑制KB／V细胞中的PI3K／Akt／mTOR信号通路

10．PPZ增强VCR对小鼠体内KB／V细胞移植瘤的生长抑制作用

10．1 PPZ增强VCR对KB／V细胞移植瘤的生长抑制作用

10．2 PPZ和VCR合用对KB／V移植瘤凋亡相关蛋白的表达调节

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文