黄翅大白蚁及其共生菌由来β-葡萄糖苷酶的研究

摘要

纤维素是植物细胞壁的主要成分，是自然界中最丰富的聚合物，也是取之不尽用之不竭的生物能源，是目前最为热门的研究材料之一。利用纤维素酶将纤维素转化成单糖，通过微生物发酵过程将单糖转化成乙醇等生物燃料，其具有重要的应用前景。纤维素水解为单糖，需要一系列纤维素酶的作用，而β-葡萄糖苷酶作为这一过程中的限速酶，起着至关重要的作用，是利用天然纤维素材料的瓶颈。
　　近年来，大量文献表明占据白蚁总数75％的高等白蚁具有较强的降解纤维素的能力。本文以高等培菌白蚁黄翅大白蚁Macrotermes barneyi为研究对象，前期在中肠克隆得到的β-葡萄糖苷酶基因(MbmgBG1)，其属于GHF1家族，与其他来源的β-葡萄糖苷酶相比，具有较高的葡萄糖耐受性，但酶活力低、热稳定性差，限制了β-葡萄糖苷酶在食品领域以及工业领域的应用。为了得到酶学性质较好的β-葡萄糖苷酶，我们进行了以下研究:
　　1.黄翅大白蚁由来β-葡萄糖苷酶的分子改造。先前研究了高等培菌白蚁黄翅大白蚁自身来源的β-葡萄糖苷酶，对其转录组进行分析，只有一个GHF1家族的β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)有活性，其葡萄糖耐受性高(1.5mol/L的葡萄糖，保持60％以上的酶活力)，但酶活力低和热稳定性差限制了β-葡萄糖苷酶(MbmgBG1)在食品以及工业领域中的应用。我们对其高度保守区域附近的非保守氨基酸进行定点突变，获得点突变体(F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M)，其中突变体F167L、R354K的比活力(底物pNPG)比野生型分别高出约2倍和4倍。突变体的Kcat/Km值比野生型大，反映了突变体对底物的亲和力以及催化能力比野生型强。当酶活力保留60％以上时，野生型所耐受的葡萄糖浓度为1.5mol/L，而F167L为2.0mol/L，R354K为3.0mol/L。
　　2.大白蚁营发酵单胞菌Dysgonomonas macrotermitis由来β-葡萄糖苷酶的研究。高等白蚁是天然降解纤维素模式生物中降解能力最高的，几乎能完全降解自身食用的天然纤维素材料。白蚁自身的β-葡萄糖苷酶远远不能完全降解白蚁食用的纤维素材料，但白蚁肠道内的共生微生物具有较强的纤维素降解能力。其中黄翅大白蚁后肠内分离得到的D.macrotermitis菌株（后肠内的第二优势菌群）具有较高的纤维素酶活力。我们对在D.macrotermitis的β-葡萄糖苷酶基因进行分析研究，共发现了15个的β-葡萄糖苷酶基因，进行异源表达后，其中6个具有活性。
　　3.大白蚁营发酵单胞菌Dysgonomonas macrotermitis由来β-葡萄糖苷酶(DysbglE)的表达与分析。对D.macrotermitis由来β-葡萄糖苷酶活性最高的DysbglE进行核苷酸序列分析。DysbglE的基因含有一个开放阅读框架(ORF)，2286个碱基对编码一个多肽，其中66个碱基对编码的为信号肽，属于GHF3家族。去除信号肽，在大肠杆菌JM109中异源表达，分子量为80.15kDa，通过分子筛分析推测其可能为同源二聚体，在DysbglE的催化反应中Arg612和Phe623起到至关重要的作用。对DysbglE酶学性质分析，其最适反应温度和pH分别为45℃和5.5;以pNPG为底物时，Km值和Vmax分别为1.4mM和666.67U/mg;葡萄糖耐受性较差，IC50为0.1mol/L。
　　4.β-葡萄糖苷酶基因(DysbglE)在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及产酶条件优化。在食品领域中，β-葡萄糖苷酶可作为食品添加剂和水果风味增香剂，这要求我们使用易于纯化、安全性高的表达系统。枯草芽孢杆菌具有长期制备发酵食品的历史，属于一般公认安全(GRAS)微生物范畴，具有蛋白质分泌能力。所以我们选择枯草芽孢杆菌WB800N异源分泌表达β-葡萄糖苷酶，更有利于促进β-葡萄糖苷酶在食品领域的应用。本实验在枯草芽孢杆菌WB800N中成功分泌表达了β-葡萄糖苷酶DysbglE，并利用响应面分析优化其发酵条件，比最初表达量提高了4-5倍。
　　总之，本文首先改造了黄翅大白蚁自身的β-葡萄糖苷酶基因MbmgBG1，其次分析了D.macrotermitis由来的全部β-葡萄糖苷酶基因(15个)，它们都属于GH3家族，其中6个在大肠杆菌中表达，对其中酶活性最高的β-葡萄糖苷酶(DysbglE)进行了详细的酶学性质研究。同时利用枯草芽孢杆菌表达系统成功分泌表达了β-葡萄糖苷酶DysbglE。本研究使我们更加深入的理解了白蚁对纤维素材料的降解能力，同时也为研究白蚁及其共生微生物的共生机制奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

1．1 白蚁

1．1．1 白蚁概述

1．1．2 黄翅大白蚁

1．1．3 培菌白蚁的共生微生物

1．1．4 黄翅大白蚁肠道优势菌Dysgonomonas

1．2 β-葡萄糖苷酶

1．2．2 GHF1家族β-葡萄糖苷酶

1．2．3 GHF3家族β-葡萄糖苷酶

1．3 β-葡萄糖苷酶的应用

1．3．2 β-葡萄糖苷酶的应用现状

1．4 本文的立题依据和研究内容

1．4．1 立题依据

1．4．2 研究内容

第二章 黄翅大白蚁由来β-葡萄糖苷酶的分子改造

2．1 引言

2．2 实验材料、试剂及仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂与仪器设备

2．3．1 构建突变体表达载体

2．3．2 诱导表达

2．2．3 纯化

2．2．4 酶活力测定方法

2．4 实验结果

2．4．2 同源建模和突变体的选择

2．4．3 突变体的构建

2．4．4 突变体酶活分析

2．4．5 突变位点对酶稳定性的影响

2．4．6 葡萄糖耐受性

2．4．7 突变体的三维结构分析

2．5 小结与讨论

第三章 大白蚁营发酵单胞菌由来β-葡萄糖苷酶的研究

3．1 引言

3．2 实验材料、试剂及仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂及仪器

3．3 实验方法

3．3．2 进化树与分子模建分析

3．3．3 分子克隆与载体的构建

3．3．4 平板验证酶活力

3．3．5 蛋白表达

3．3．6 酶活力测定方法

3．4 实验结果

3．4．1 生物信息学分析Dysbgls

3．4．2 在大肠杆菌JM109菌株中表达Dysbgls

3．4．3 生物信息学分析具有活性的β-葡萄糖苷酶Dysbgls

3．5 小结与讨论

第四章 大白蚁营发酵单胞菌由来DysbglE的克隆与表达

4．1 引言

4．2 实验材料、试剂及仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验试剂及仪器

4．3 实验方法

4．3．1 分子模建与进化树

4．3．2 分子克隆

4．3．3 蛋白表达与纯化

4．3．5 酶活力测定方法

4．3．6 酶学性质测定

4．4 实验结果

4．4．1 生物信息学分析

4．4．2 在大肠杆菌JM109菌株中表达

4．4．3 酶学性质分析

4．4．4 同源建模分析三维结构

3．5 小结与讨论

第五章 β-葡萄糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达与产酶条件优化

5．1 引言

5．2 实验材料、试剂与仪器

5．2．1 实验材料

5．2．2 实验试剂与仪器

5．3 实验方法与步骤

5．3．1 载体的构建与转化

5．3．2 分泌表达与产酶条件优化

5．3．3 蛋白的纯化

5．3．4 酶活力测定方法

5．4 实验结果

5．4．1 DysbglE在枯草芽孢杆菌WB800N中表达

5．4．2 枯草芽孢杆菌WB800N与大肠杆菌JM109表达体系的比较

5．4．3 响应面分析枯草芽孢杆菌WB800N表达体系的条件

5．5 小结与讨论

第六章 总结与展望

附录

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文