基于Nrf2信号通路的天然抗氧化剂研究

摘要

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化而导致组织损伤的生理病理反应。已证实氧化应激与肺部疾病的病理进程密切相关。由于外界环境中的氧化物和毒物与肺组织直接接触，更易引起肺组织氧化应激并诱发急性或慢性病变。核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2)是细胞内调节氧化还原平衡的重要转录因子，激活Nrf2信号通路能够抑制肺组织氧化应激反应、干预肺部疾病的病理进程。中药和天然药物是Nrf2激动剂和肺部疾病防治药物及先导化合物的重要来源。本课题以中药和天然药物为研究对象，基于Nrf2信号通路，发现具有抗氧化活性和Nrf2激动作用的提取物和活性分子，探讨其作用机制，并揭示其干预肺组织细胞氧化损伤的有效性。
　　本课题收集并制备了196种中药乙醇提取物，采用高通量醌还原酶(QR)诱导活性实验评价其抗氧化活性，高通量NO生成抑制实验评价其抗炎活性，构建了具有氧化应激和炎症反应抑制活性的中药提取物库。我们将最大QR诱导活性(MQI)≥1.3作为有抗氧化活性的标准;将最大NO生成抑制率(MIR)≥30％作为有抗炎活性的标准。发现39种中药提取物具有抑制氧化应激活性;56种中药提取物具有抑制炎症反应活性;20种中药提取物具有双重抑制氧化应激和炎症反应活性。通过构建具有Nrf2诱导活性的中药提取物库，为系统开展天然Nrf2诱导活性分子研究奠定了基础。
　　坚叶樟(Cinnamomum chartophyllum H.W.L)为樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)植物。本课题组前期研究发现坚叶樟乙醇提取物具有Nrf2诱导活性，并分离获得了30个化合物。在此基础上，本课题:(1)采用高通量QR诱导实验评价了化合物氧化应激抑制活性和潜在的Nrf2激动作用，发现倍半萜类化合物3S-(+)-9-氧橙花叔酮[3S-(+)-9-oxonerolidol,NLD，1]，联苯类化合物3，3’，4，4’-四羟基联苯（3，3’，4，4’-tetrahydroxydiphenyl，THD，2），1个木脂素类化合物，以及3个黄酮类化合物具有较好的QR诱导作用。(2)采用人乳腺癌MDA-MB-231细胞系确证NLD和THD对Nrf2信号通路的激动作用，发现NLD和THD能够促进Nrf2转录，并能上调Nrf2及其下游基因NQO1和γ-GCS的蛋白水平。NLD和THD均为首次发现的Nrf2激动剂。(3)采用人支气管上皮Beas-2B细胞探讨了NLD和THD激活Nrf2信号通路的作用机制，发现在无毒的剂量下，NLD和THD能够剂量依赖和时间依赖地诱导Nrf2、NQO1和γ-GCS的蛋白表达，对Keap1蛋白表达无影响;12.5μM NLD和THD能够诱导Nrf2转位入核，并且使其半衰期由15min左右延长至25.8min和31.7min。(4)采用分子对接分析发现:THD与Keapl中Leu365，Ser508和Leu557形成分子间氢键，氢键键长分别为1.6(A)，2.4(A)和1.7(A)。(5)采用As(Ⅲ)诱导的Beas-2B细胞损伤模型评价了NLD和THD对细胞氧化损伤的保护作用，发现NLD和THD预处理的细胞生存率明显提高;NLD和THD能够增加内源性抗氧化剂还原型GSH的含量、减少As(Ⅲ)诱导的ROS生成，同时NLD和THD本身对ROS释放量无影响;AO/EB双染法和Annexin V-FITC/PI流式细胞分析表明，NLD和THD对As(Ⅲ)诱导的Beas-2B细胞损伤具有保护作用。上述结果表明，NLD和THD对氧化应激相关疾病（如COPD，糖尿病，心血管疾病）具有潜在的防治作用。
　　黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗炎、治疗心血管疾病和神经系统疾病等多样的生物活性。本课题组收集得到74个黄酮类化合物，高通量QR诱导实验结果发现，8个黄酮及黄酮醇类化合物，6个二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物，10个查尔酮及二氢查尔酮类化合物，以及1个异黄酮类化合物具有较好的QR诱导作用。其中，20个化合物为首次发现具有Nrf2激动作用。本实验选取化合物(2S)-5，6，7，3’，4’-五甲氧基黄酮[(2S）-5，6，7，3’，4’-pentamethoxyflavanone，PMF]作为黄酮代表，开展了深入的作用机制研究和体外活性评价。(1)采用人支气管上皮Beas-2B细胞探讨了其激活Nrf2信号通路的作用机制及保护作用。结果表明，PMF能够促进Nrf2、NQO1、γ-GCS蛋白水平和NQO1、GCLM mRNA水平的表达，诱导Nrf2蛋白转位入核，并增加其稳定性。(2)采用As(ⅢⅢ)诱导氧化损伤模型和香烟烟雾(CSE)诱导氧化损伤模型初步评价其对肺部氧化损伤的保护作用，发现PMF预处理能够提高细胞生存率并抑制As(Ⅲ)和香烟烟雾提取物诱导的ROS生成，流式结果也表明对As(Ⅲ)和CSE诱导的Beas-2B细胞损伤具有保护作用;通过Nrf2小分子干扰RNA(Nrf2-siRNA)沉默Beas-2B细胞中Nrf2基因表达，发现PMF保护作用消失，表明PMF的抗氧化损伤作用是通过Nrf2信号通路介导的。上述结果表明，PMF能够激活Nrf2通路，并对肺部氧化损伤病变(如COPD)具有潜在的防治作用。
　　氧化应激在肺部疾病病理进程中起重要作用，激活Nrf2通路是抵抗肺组织外源性氧化损伤的有效手段。本课题建立具有Nrf2诱导活性的中药提取物库，系统研究坚叶樟成分Nrf2诱导活性及作用机制，探讨了黄酮类化合物激活Nrf2通路构效关系及激活机制，并评价了活性分子抑制肺部氧化损伤的有效性。同时，本课题发现了一些具有较好氧化应激抑制活性的中药提取物单体分子，也为中药防治肺部疾病提供了方向和思路，为进一步深入开展中药和天然药物来源Nrf2激动剂防治肺部疾病研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 Nrf2信号通路研究概述

1 Nrf2通路

2 Nrf2与氧化应激

3 Nrf2与肺部疾病

参考文献

1 前言

2 实验材料

2．1 细胞株

2．2 试剂

2．3 中药药材

2．4 相关溶液的配制

2．5 主要仪器

3 实验方法

3．1 中药提取物制备

3．2 细胞培养条件

3．3 细胞加药

3．4 醌还原酶诱导活性实验

3．5 一氧化氮生成抑制实验

3．6 MTT法

3．7 统计与分析

4 实验结果

4．1 中药提取物氧化应激抑制作用评价

4．2 中药提取物炎症反应抑制作用评价

4．3 中药提取物氧化应激和炎症反应双重抑制作用评价

5 讨论与总结

参考文献

第三章 坚叶樟中Nrf2激动剂对人支气管上皮细胞的保护作用

1 前言

2 实验材料

2．1 细胞株

2．2 化合物

2．3 试剂

2．4 相关溶液配制

2．5 主要仪器

3 实验方法

3．1 细胞培养条件

3．2 细胞加药

3．3 醌还原酶诱导活性检测

3．4 MTT法

3．5 双荧光素酶报告基因实验

3．6 免疫印迹法

3．7 免疫荧光染色

3．8 蛋白半衰期检测

3．9 细胞内还原型谷胱甘肽含量测定

3．10 细胞内活性氧测定

3．11 吖啶橙／溴化乙锭双荧光染色

3．12 Annexin V-FITC／PI双染法

3．13 分子对接

3．14 统计与分析

4 实验结果

4．1 坚叶樟化学成分QR诱导活性评价

4．2 NLD和THD对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中Nrf2的激动作用

4．3 NLD和THD对人支气管上皮Beas-2B细胞中Nrf2的激动作用

4．4 NLD和THD对As(Ⅲ)诱导的Beas-2B细胞损伤的保护作用

5 讨论与总结

参考文献

第四章 黄酮激活Nrf2信号通路的构效关系及作用机制

1 前言

2 实验材料

2．1 细胞株

2．2 化合物

2．3 试剂

2．4 相关溶液配制

3．3 醌还原酶诱导活性检测

3．4 MTT法

3．5 双荧光索酶报告基因实验

3．6 免疫印迹法

3．8 核质分离实验

3．9 泛素化检测

3．10 蛋白半衰期检测

3．11 细胞内还原型谷胱甘肽含量测定

3．15 RT-PCR

3．17 RNA干扰

3．18 统计与分析

4 实验结果

4．1 黄酮类化合物QR诱导活性评价及构效关系分析

4．2 PMF对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中Nrf2的激动作用

4．3 PMF对人支气管上皮Beas-2B细胞中Nrf2的激动作用

4．4 PMF对As(Ⅲ)诱导的Beas-2B细胞损伤的保护作用

4．5 PMF对香烟烟雾诱导的Beas-2B细胞损伤的保护作用

5 讨论与总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

附录