苔类植物和江南卷柏苯丙烷代谢途径相关基因的功能研究

摘要

苔藓植物是最原始的陆生高等植物，在进化上介于藻类植物和蕨类植物之间，分为苔纲、藓纲、角苔纲三类。苔藓植物中的次级代谢产物主要分为萜类化合物和芳香族化合物两大类，具体到苔类植物中，主要是萜类和单联苄、双联苄等化合物。苔类植物中的许多代谢产物具有很好的药理学活性，如抗肿瘤、抗微生物、抗病毒、抗氧化以及昆虫拒食等，有成药的潜质。但是受限于苔类植物的体积较小、族群混杂，分离富集到足够的生物量进行研究一直是一大难题。分子生物学和代谢工程技术为解决该问题提供了一个有效手段。双联苄类化合物是苔类植物所特有的，但是该类化合物的生物合成途径目前仍未得到清晰的阐述。前人通过同位素标记的方法，推测出苔类植物的双联苄类化合物来自苯丙烷代谢途径，因此有必要对该条代谢途径上的关键酶进行研究。
　　卷柏目(Selaginellales)与石松目(Lycopodiales)和水韭目(Iso(e)tales)—起构成了石松门这一世界上现存的最古老的维管植物株系。卷柏类植物中富含木质素和黄酮类化合物，虽然这两类化合物已经被大量分离提取，但是对它们在卷柏类植物中的生物合成途径了解的还不够多。木质素和黄酮类化合物的生物合成均来源于苯丙烷代谢途径，因此对于卷柏类植物中的苯丙烷代谢途径上关键酶的研究将有助于我们进一步了解植物次级代谢系统在整个陆生植物进化史中的演变情况。
　　本文分析了几种苔类植物的转录组数据库、基因组数据库和江南卷柏的基因组数据库，筛选出了几个苯丙烷代谢途径上的关键基因进行研究。从钝鳞紫背苔和粗裂地钱中共克隆得到3个肉桂酸4-羟化酶(C4H)基因，对其体外功能以及在酵母体内的功能进行了研究，并对非生物胁迫下表达量随时间的关系进行了研究;从江南卷柏中克隆得到2个对羟基肉桂酰辅酶A连接酶(4CL)，鉴定了其体外生化特征以及基因的组织表达情况;从江南卷柏中克隆得到三个查尔酮合成酶(CHS)超家族的基因，对其进行了体外酶活分析并对影响酶缩合丙二酸单酰基-CoA次数的关键氨基酸进行了研究;对苔类植物的半月苔酸合成途径进行了初步的探索。主要的研究内容及结果如下:
　　1.苔类植物肉桂酸4-羟化酶的克隆和功能研究
　　从钝鳞紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)和粗裂地钱(Marchantia paleacea)的转录组数据库中筛选得到3个注释为肉桂酸4-羟化酶(C4H)的基因，将它们分别命名为PaC4H，MpC4H1和MpC4H2。生物信息学分析显示，它们与其他植物来源的C4Hs具有60-70％的序列相似性。序列比对发现它们都具有P450单加氧酶超家族的保守结构域:膜定位结构域(P/IPGPXG/PXP)，血红素结合结构域(PFGXGRRXCXG)和结合口袋(AAIETT)。对其进行进化地位分析，发现它们与小立碗藓(Physcomitrella patens)中的PpC4H亲缘关系最接近，符合传统的植物进化进程。
　　构建酵母表达载体并转入酵母细胞内进行表达。提取微粒体并进行体外酶活实验，结果发现目的蛋白能够催化反式肉桂酸生成对羟基肉桂酸，也能够催化3-羟基肉桂酸生成咖啡酸。但是这些酶对于底物的催化效率不同，酶学动力学分析表明MpC4H2的催化效率远低于PaC4H和MpC4H1。与此相对应的是，PaC4H和MpC4H1彼此之间的序列相似性更高，MpC4H2与它们相比差异较大，而且MpC4H2的进化地位更为原始。因此我们猜测序列较为原始的C4H催化活性也较低。将PaC4H和实验室前期研究过的钝鳞紫背苔中的苯丙氨酸裂解酶(PaPAL)共同转入酵母细胞中，饲喂底物L-苯丙氨酸，发现能够高效的生成产物对羟基肉桂酸，说明PaPAL和PaC4H在酵母体内保持了正确的折叠和蛋白-蛋白相互作用。此外，PaC4H的基因表达受到紫外光照射(UV-B)和激素水杨酸(SA)的诱导。
　　2.江南卷柏对羟基肉桂酰辅酶A连接酶的克隆和功能研究
　　通过对江南卷柏(Selaginella moellendorffii)的基因组数据库进行分析，共筛选得到2个注释为对羟基肉桂酰辅酶A连接酶(4CL)的基因，分别命名为Sm4CL1和Sm4CL2。序列信息学分析发现它们与其他植物物种中的4CLs具有55-60％的序列相似性。序列比对发现它们都具有4CL家族中的保守功能域:AMP-结合功能域(boxⅠ)和“GEICIRG”功能域(boxⅡ)。进化地位分析发现它们与来自苔藓植物和裸子植物的4CLs聚在一起，符合植物的进化历程。
　　构建原核表达载体，在大肠杆菌中进行蛋白表达并纯化得到重组蛋白。体外酶活实验发现Sm4CL1和Sm4CL2均以对羟基肉桂酸为最适底物，生成对羟基肉桂酰辅酶A(p-coumaroyl-CoA)，但是它们的催化效率有所不同，Sm4CL1的催化效率远低于Sm4CL2。此外，在对江南卷柏中目的基因的组织表达情况进行分析时发现这两个基因均在根部的表达量最高。
　　3.江南卷柏查尔酮合成酶超家族基因的克隆和功能研究
　　查尔酮合成酶(CHS)超家族成员属于Ⅲ型聚酮合酶，由CHS和CHS-like基因共同构成。本文从江南卷柏的基因组数据库中筛选得到3个注释为CHS超家族的基因。对它们进行生物信息分析，发现其中一个基因与注释成花药特异性类查尔酮合成酶(ASCL)的基因之间有50-60％的相似度，并且在进化树分析时与ASCL聚成一簇;另两个基因与其他植物来源的CHSs之间具有61-67％的序列相似度，进化分析时与CHS聚成一簇。根据生物信息学分析结果，将这3个基因分别命名为SmCHSL1，SmCHS2和SmCHS3。
　　构建原核表达载体并进行蛋白的诱导表达。对纯化的蛋白进行体外酶活分析，发现SmCHS2和SmCHS3能够以p-coumaroyl-CoA为起始底物生成柚皮素查尔酮(naringenin chalcone)。CHS反应经常伴随着两个内酯化副产物的产生:二次缩合的α-吡喃酮衍生物bisnoryangonin(BNY)和三次缩合的α-吡喃酮衍生物4-coumaroyltriacetic acid lactone(CTAL)。但是这两个酶的催化效率不同，SmCHS3的催化效率远低于SmCHS2。我们发现SmCHS2基因的组织表达情况与总黄酮的组织分布趋势一致，SmCHS3基因的组织表达情况与总黄酮的组织分布无关，从体外酶活和体内基因表达两方面证明了在植物体内SmCHS2更多的参与了黄酮的生物合成。SmCHSL1能够以p-coumaroyl-CoA为起始底物，仅生成一个产物BNY。为了探究关键氨基酸对于查尔酮合成酶超家族的功能影响，我们对SmCHSL1进行了点突变。结果发现Pro-210，Tyr-211共同突变为Leu-210，Asp-211后，突变体除生成BNY外还能够生成CTAL。关键氨基酸的突变影响了酶的缩合反应次数，这在ASCL的研究中尚属首次。
　　4.苔类植物中半月苔酸生物合成机制的初步研究
　　Schr(O)der等提出苔类植物中半月苔酸的生物合成是由羧酸芪类合成酶(STCS)和聚酮还原酶(PKR)共同催化的。本文从钝鳞紫背苔和粗裂地钱的cDNA文库中共克隆出4个可能具有聚酮还原酶(PKR)功能的基因，将它们与实验室前期获得的STCSs一起进行体外酶活实验，发现它们均不能与STCS共同作用生成半月苔酸。将STCS与PKR进行体内异源表达实验，分别使用了酵母、大肠杆菌和烟草作为宿主，也未能实现半月苔酸的生物合成。此外，钝鳞紫背苔体内的STCS基因表达水平与半月苔酸含量的变化趋势呈现出弱相关，但是相关关系并不明显。通过分析地钱的基因组数据库，筛选出可能的STCSs和PKRs，但是酵母双杂实验并未找到具有相互作用的基因。

目录

声明

摘要

符号说明

1 苔藓植物

2 石松门植物

3 苯丙烷代谢途径

3．1 联苄类化合物生物合成途径

3．2 苯丙氨酸裂解酶

3．3 肉桂酸 4-羟化酶

3．4 对羟基肉桂酰辅酶A连接酶

3．5 植物Ⅲ型聚酮合酶

3．6 聚酮还原酶

4 本论文立题依据和研究内容

参考文献

第二章 苔类植物肉桂酸 4-羟化酶的克隆和功能鉴定

1 引言

2 实验材料与试剂

2．1 植物材料

2．2 菌株与质粒

2．3 酶和试剂

2．4 溶液和培养基

2．5 仪器设备

2．6 PCR引物序列

3 实验方法

3．1 钝鳞紫背苔和粗裂地钱中肉桂1-4-羟化酶的克隆

3．2 目的基因的酵母表达与微粒体制备

3．3 C4H的体外酶活实验

3．4 对羟基肉桂酸生物合成途径在酵母体内的重构

3．5 逆境胁迫和目的基因的转录水平分析

4 实验结果

4．1 目的基因的克隆与序列分析

4．2 酵母表达载体的构建及提取微粒体

4．3 肉桂酸4-羟化酶的体外功能研究

4．4 PaC4H的体内异源表达和功能鉴定

4．5 非生物胁迫对PaC4H表达的影响

5 本章小结

参考文献

第三章 江南卷柏对羟基肉桂酰辅酶A连接酶的克隆和功能鉴定

1 引言

2 实验材料与试剂

2．1 植物材料

2．2 试剂与设备

2．3 主要溶液和培养基

2．4 PCR引物序列

3 实验方法

3．1 目的基因克隆

3．2 目的基因原核表达载体的构建

3．3 蛋白表达与纯化

3．4 4CL的体外酶活实验

3．5 目的基因的组织表达情况的分析

3．6 进化地位分析

4 实验结果

4．2 序列特征分析

4．3 原核表达载体的构建与蛋白纯化

4．4 体外功能研究

4．5 目的基因的组织表达情况

5 本章小结

参考文献

第四章 江南卷柏CHS超家族基因的克隆和功能鉴定

1 引言

2 实验材料与试剂

2．1 试剂与设备

2．2 PCR引物序列

3 实验方法

3．1 目的基因的克隆

3．2 目的蛋白表达

3．3 体外酶活实验

3．4 SmCHSL1突变体的构建及体外酶活分析

3．5 目的基因的组织表达情况的分析

3．6 不同植物组织中总黄酮含量分析

3．7 进化地位分析

4 实验结果

4．1 基因克隆

4．2 序列特征分析

4．3 原核表达载体的构建与蛋白纯化

4．4 体外功能研究

4．5 SmCHSL1双突变体SmCHSL1-PY210LD的构建和蛋白纯化

4．6 SmCHSL1双突变体的体外酶活实验

4．7 目的基因的组织表达情况和总黄酮的组织分布

5 本章小结

参考文献

1 引言

2 实验材料与试剂

2．1 植物材料

2．2 菌株与质粒

2．3 主要试剂

2．4 培养基与溶液

2．5 PCR引物序列

3 实验方法

3．1 PKR基因的克隆

3．2 PKR蛋白表达与体外酶活实验

3．3 STCS与PKR在酵母共表达

3．4 STCS与PKR在大肠杆菌共表达

3．5 STCS与PKR在烟草中共表达

3．6 愈伤组织中STCS基因表达调控

3．7 STCS与PKR的酵母双杂交实验

4 实验结果

4．1 基因克隆

4．2 序列信息学分析

4．3 STCS与PKR的体外酶活结果

4．4 STCS与PKR的体内异源表达

4．5 STCS的体内功能研究

4．6 地钱中STCS与PKR的蛋白相互作用的关系

5 本章小结

参考文献

总结和展望

致谢

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