应用嵌合性抗原受体T细胞过继性治疗实体瘤的临床前研究

摘要

背景：
　　胃癌(Gastric Cancer，GC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，是世界上发病率排名第5位、死亡率排名第3位的恶性肿瘤，尤以东亚地区最高。中国是胃癌高发国家，多数病人初诊时已无法手术或发生转移，预后较差。虽然目前有化疗、放疗、手术联合的胃癌综合治疗，但无法手术的晚期胃癌的死亡率仍然不容乐观。人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor2，HER2）在多种恶性肿瘤中过表达，并在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。研究表明胃癌患者中HER2过表达率从9％到23％不等，HER2在胃癌中过表达的发现为胃癌提供了新的靶向治疗策略。曲妥珠单抗是HER2阳性、晚期或转移性胃癌的首例靶向治疗药物。但是曲妥珠单抗的临床获益仍然有限，且其昂贵的成本、心脏毒性以及获得性耐药都限制了其广泛的临床应用。因此，胃癌亟需新的有效治疗手段，为晚期胃癌患者探寻靶向HER2的主动免疫治疗策略具有重要的临床意义。
　　嵌合性抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞是近年来肿瘤免疫治疗的热点，也是最有前景的抗肿瘤治疗手段之一。表达CAR的T细胞可以通过胞外的单链可变结构域（single-chain variable fragment，scFv）直接识别肿瘤细胞表面的肿瘤相关性抗原(Tumor associated antigen，TAA)，通过胞内信号传导激活T细胞，释放穿孔素、颗粒酶及干扰素-γ、肿瘤坏死因子等多种细胞因子，诱导肿瘤细胞的凋亡坏死。因此，CART细胞的作用模式是无MHC限制性的，并且巧妙地结合了抗体特异性识别抗原的能力和T淋巴细胞的细胞毒作用。CART细胞疗法首先在血液系统肿瘤中获得了伟大的成功，此后在实体瘤的临床试验及临床前研究中同样展现出其优势以及令人振奋的结果。与单克降抗体治疗相比，CAR T细胞治疗具有抗肿瘤作用更持久、抗瘤谱广、作用精准、不良反应少、耐药风险低等优势。以HER2为靶点的CART细胞治疗已在多种肿瘤中被广泛探究，包括乳腺癌，卵巢癌，胆管癌和胰腺癌，髓母细胞瘤，胶质母细胞瘤，骨肉瘤等，部分HER2特异性的CART细胞治疗已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验。但是目前CART细胞对胃癌的治疗潜能尚未被广泛研究和报道。
　　目的：
　　本研究旨在构建HER2特异性的chA21 scFv-4-1BBz CAR并转染人T淋巴细胞;探究chA21 scFv-4-1BBz CAR T细胞在体外特异性识别和杀伤HER2高表达肿瘤细胞的能力，及其在体内抑制HER2高表达的胃癌的生长和进展的作用，以期为晚期胃癌提供一种新的免疫靶向治疗策略。
　　方法：
　　1.流式细胞仪分析人胃癌细胞株表面HER2受体的表达水平。
　　2.应用重叠延伸PCR技术(overlap extension PCR，OE-PCR)连接构建CD8aleader-chA21 scFv-CD8a hinge-4-1BB-CD3z质粒。将构建好的chA21-4-1BBzCAR DNA接入pSin慢病毒骨架形成pSin-GFP-chA21-4-1BBz质粒，并使用脂质体转染法包装慢病毒。
　　3.利用慢病毒载体转染chA21-4-1BBz CAR至人T淋巴细胞，流式细胞术分析chA21-4-1BBz CAR在T细胞表面的表达效率。
　　4.通过流式多因子检测法检测chA21-4-1BBz CAR T细胞在体外与表达不同水平HER2的肿瘤细胞共培养时分泌Th1型（IL-2、TNF-α、INF-γ）、Th2型(IL-4、IL-6、IL-10)、Th17型(IL-17A)共七种细胞因子的情况。
　　5.设置1∶1，3∶1，10∶1，30∶1四种不同的效靶比（T细胞:肿瘤细胞），利用LDH释放实验评价在体外chA21-4-1BBz CAR T细胞对不同HER2表达水平的肿瘤细胞的特异性杀伤能力。
　　6.选择NOD-SICD雌性小鼠背部左右两侧分别皮下接种HER2高表达的NCI-N87细胞和HER2低表达的MKN-28细胞从而建立自对照人胃癌小鼠皮下移植瘤模型;40天后分组给予chA21-4-1BBz CAR T细胞或未转染的T细胞(Untransduced T cells，UT T cells)尾静脉输注治疗并监测两组T细胞输注对胃癌皮下移植瘤生长的影响。
　　7.T细胞治疗30天后，从小鼠内眦静脉取血，分离小鼠外周血单个核细胞，行抗人CD3抗体染色。流式细胞术分析评估chA21-4-1BBz CAR T细胞在小鼠外周血中的生存情况。
　　8.收集各组小鼠剥离的肿瘤，OCT包埋制备冷冻组织切片，免疫组化分析人CD3+T细胞在各组肿瘤组织内的聚集情况，评价chA21-4-1BBz CAR T细胞在肿瘤位点的浸润聚集。
　　9.选取NOD-SCID雌性小鼠腹腔内注射NCI-N87细胞建立人胃癌小鼠腹膜移植瘤模型;肿瘤接种后第7、10天分组给予腹腔注射chA21-4-1BBz CAR T细胞或UTT细胞，并监测两组T细胞输注对胃癌腹腔种植瘤的疗效。
　　结果：
　　1.人胃癌细胞系NCI-N87高表达HER2，HGC-27、MKN-45、BGC-823中度表达HER2，MKN-28表达极低水平的HER2。
　　2.成功构建了HER2特异性的chA21-4-1BBz CAR，慢病毒转染人T淋巴细胞后， CAR表达效率高于50％; chA21-4-1BBz CAR转染的T细胞及UT T细胞均在体外培养体系中扩增良好。
　　3.chA21-4-1BBz CAR T细胞在体外能特异性识别HER2高表达的SKOV3、NCI-N87细胞并释放高水平的IL-2、TNF-α、INF-γ等Th1型细胞因子，对HER2中度表达的HGC-27、MKN-45、BGC-823细胞的识别及应答能力相对较弱，而对HER2极低表达的MKN-28细胞无明显应答。chA21-4-1BBz CAR T细胞分泌的IL-2、TNF-α、INF-γ细胞因子的浓度与靶细胞表面HER2表达水平呈正相关。
　　4.chA21-4-1BBz CAR T细胞可特异性杀伤HER2高表达的SKOV3、NCI-N87肿瘤细胞，随着效靶比升高杀伤效率增强，对中度表达HER2的MKN-45细胞的杀伤能力相对较弱，对HER2极低表达的MKN-28细胞无明显杀伤作用。
　　5.成功建立人胃癌小鼠皮下移植瘤自对照模型。相较于UT T细胞治疗，chA21-4-1BBz CART细胞治疗明显抑制了NCI-N87肿瘤的生长，差异有统计学意义(P＜0.05)，接受不同T细胞治疗的MKN-28移植瘤生长无明显差异(P＞0.05);统计分析各组肿瘤重量得出，chA21-4-1BBz CAR T细胞治疗较UT T细胞治疗的小鼠NCI-N87肿瘤负荷明显减小(268±50 mg vs648±18 mg，P＜0.001)，而MKN-28肿瘤负荷无明显差异(718±79 mg vs678±72 mg，P＞0.05)。
　　6.荷瘤小鼠接受T细胞治疗30天后，在小鼠外周血中成功检测到输注的chA21-4-1BBz CAR T细胞的存活，但未见检测到UT T细胞;免疫组化结果显示，对于HER2高表达的NCI-N87肿瘤组织，仅有chA21-4-1BBz CAR T细胞治疗的肿瘤病灶内检测到明显的人CD3+T细胞聚集。对于HER2极低表达的MKN-28肿瘤组织，两组T细胞治疗的肿瘤组织均未检测到人CD3+T细胞聚集。
　　7.成功建立人胃癌小鼠腹膜移植瘤模型，对照组UTT细胞治疗的小鼠腹腔内均观察到血性腹水和多发肿瘤病灶;而chA21-4-1BBz CART细胞腹腔注射有效抑制了HER2高表达的NCI-N87腹膜种植瘤的生长进展，解剖查见极少量的肿瘤结节，无血性腹水。chA21-4-1BBz CAR T细胞腹腔注射明显延长了荷瘤小鼠的生存期，差异具有统计学意义(P＜0.001)。
　　结论：
　　1.chA21-4-1BBz CAR T细胞在体外能特异性识别HER2阳性肿瘤细胞并释放高水平的Th1型细胞因子，并且能特异性杀伤裂解HER2高表达的肿瘤细胞。
　　2.chA21-4-1BBz CAR T细胞静脉输注到小鼠体内后可特异性识别HER2抗原，在肿瘤位点浸润聚集，有效抑制HER2高表达的胃癌皮下移植瘤的生长进展，而对HER2低表达的肿瘤无明显作用。
　　3.chA21-4-1BBz CAR T细胞腹腔注射能有效抑制HER2高表达的人胃癌小鼠腹膜种植瘤的进展并延长荷瘤小鼠的生存期。
　　4.我们构建的HER2特异性的chA21-4-1BBz CAR T细胞对于HER2阳性晚期胃癌是一种很有前景的治疗手段，为下一步临床试验的开展奠定了基础。

目录

声明

第一部分 应用HER2特异性的人源化嵌合性抗原受体修饰的T细胞过继性治疗胃癌的临床前研究

摘要

缩略语说明

前言

实验材料

实验方法

研究结果

讨论

附图表

参考文献

第二部分 应用NKG2D嵌合性抗原受体修饰的T细胞过继性治疗三阴性乳腺癌的临床前研究

摘要

缩略语说明

前言

实验材料

实验方法

研究结果

讨论

附图表

参考文献

致谢

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